A catalase é uma enzima que catalisa a decomposição do peróxido de hidrogénio em água e oxigénio.

Figura 1

O objetivo desta aula prática é medir a atividade da catalase em células de permeabilizadas de levedura Saccharomyces cerevisiae.

A acil-CoA oxidase é a primeira enzima da via peroxisomal da β-oxidação, responsável por catalisar a oxidação da acil-CoA, um processo que decompõe ácidos gordos.

Figura 2

Ao contrário das mitocôndrias, onde o FADH₂ entra na cadeia transportadora de eletrões, o FADH₂ peroxisomal doa diretamente os seus eletrões ao oxigénio molecular, resultando na formação de peróxido de hidrogénio (H₂O₂). Este passo é único na β-oxidação peroxisomal, já que, nas mitocôndrias, os transportadores de eletrões como o FADH₂ contribuem para a síntese de ATP através da fosforilação oxidativa. Nas peroxissomas, no entanto, o FADH₂ é rapidamente oxidado de volta para FAD, permitindo a oxidação contínua dos ácidos gordos, mas produzindo H₂O₂ como subproduto em vez de ATP.

Figura 3

Os Complexos I e III podem, inadvertidamente, perder eletrões para o oxigénio molecular, formando superóxido. O ânion superóxido (O₂⁻•) gerado nos Complexos I e III da cadeia transportadora de eletrões mitocondrial é desintoxicado principalmente pela enzima superóxido dismutase (SOD).

Figura 4

NOX1 e NOX2 são enzimas que pertencem à família da NADPH oxidase (NOX), desempenhando papéis cruciais na produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) como parte da sinalização celular e respostas imunitárias. Ao contrário da geração de ROS mitocondrial, estas enzimas geram ROS diretamente na membrana celular ou em compartimentos celulares específicos.

• Localização: Expressa principalmente em células epiteliais, incluindo as do cólon e em células musculares lisas vasculares.
• Função: A NOX1 gera superóxido (O₂⁻•), que pode ser convertido em outras ROS, como o peróxido de hidrogénio (H₂O₂).
• Papel na função celular: Envolvida na sinalização celular relacionada à proliferação, migração e respostas imunitárias. A NOX1 também está implicada na remodelação vascular, respostas inflamatórias e na progressão de alguns tipos de cancro, onde as ROS desempenham um papel na sinalização do crescimento celular.

• Localização: Conhecida principalmente pelo seu papel em células fagocíticas (como neutrófilos e macrófagos), mas também é expressa noutros tipos de células.
• Função: A NOX2 é crucial para a resposta imunitária, pois produz superóxido em fagossomas para destruir patógenos ingeridos. O superóxido gerado pela NOX2 contribui para a “explosão respiratória”, uma libertação rápida de ROS que mata bactérias e outros patógenos.
• Papel na defesa do hospedeiro: As ROS derivadas da NOX2 são críticas na defesa antimicrobiana. Defeitos hereditários na NOX2 levam a uma capacidade reduzida de combater infeções.

Figura 5

O glutationa (GSH) remove o peróxido de hidrogénio (H₂O₂) através de uma reação enzimática envolvendo a glutationa peroxidase (GPx). Esta enzima catalisa a redução do H₂O₂ em água, utilizando o glutationa como doador de eletrões.

Figura 6

O teste da catalase é um ensaio bioquímico simples utilizado para identificar organismos capazes de produzir a enzima catalase. Todos os microrganismos aeróbicos conhecidos produzem catalase. No teste (Figura 7), uma pequena quantidade de cultura bacteriana é exposta a peróxido de hidrogénio, e a formação de bolhas indica um resultado positivo, significando atividade de catalase. Este teste é frequentemente utilizado para diferenciar entre organismos catalase-positivos, como Staphylococcus spp., e catalase-negativos, como Streptococcus spp. na microbiologia clínica.

O protocolo baseia-se numa combinação de um método para preparar células de levedura permeabilizadas com etanol descrito por Trawczyńska & Wójcik 2015 e um ensaio para peróxido utilizando iões de cobalto descrito por Hadwan 2018.

Após as células serem permeabilizadas, o substrato, como o H₂O₂, consegue alcançar mais facilmente a enzima catalase, e os produtos (H₂O e O₂) conseguem sair mais facilmente (Figura 8).

Figura 7

O protocolo de permeabilização é muito simples. As células de levedura são incubadas com etanol durante 20 minutos num tampão de fosfato.

As células permeabilizadas são misturadas com peróxido de hidrogénio e incubadas durante 10 minutos a 37 °C. Durante este tempo, parte do peróxido de hidrogénio é consumido pela catalase e decomposto em oxigénio e água.

O peróxido restante é medido permitindo que este oxide o cobalto(II) para cobalto(III), que pode ser medido com um espectrofotómetro a 440 nm (Figura 9). A oxidação é realizada na presença de iões de carbonato, que formam um complexo rosa com cobalto(II) e um complexo verde com cobalto(III).

Figura 8

Estriem as duas estirpes listadas abaixo em meio sólido YPD e incubem a 30 °C durante ~48 h.

Número da Estirpe	Designação da Estirpe	Vetor Plasmídeo		Caixa	Pos
µ1886	CENPK111-32D	pTA1	vetor vazio	Björn12	35
µ1885	"	pTA1_TDH3_ScCTT1_PGI1	vetor de expressão CTT1	""	34

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Inoculem dois tubos de vidro de 50 mL ou pequenos erlenmeyers com ~5 mL de meio SD e incubem a 30 °C com agitação durante ~48 h.

Rotulem os tubos com 1885 e 1886, respetivamente. Estas culturas podem ser guardadas a 4–8 °C no frigorífico durante ~3–4 semanas.

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Esta etapa deve ser realizada na manhã do dia anterior à aula. Inoculem dois tubos de vidro de 50 mL com 5 mL do mesmo meio, utilizando 100 µL de cada pré-cultura.

Rotulem os tubos com 1885 e 1886.

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Preparem 10 mL de solução de peróxido de hidrogénio (10 mM) adicionando 12 µL de peróxido de hidrogénio a 30% a 10 mL de tampão de fosfato 50 mM (pH 7.0). Distribuam ~1 mL da solução de peróxido em quatro tubos Eppendorf, um para cada grupo.

Meçam a densidade ótica (OD) a 640 nm para as culturas. Adicionem meio fresco à cultura com maior OD de forma a igualar a densidade ótica das duas culturas.

Preparem 50 mL de solução de trabalho. A ordem de adição dos componentes é importante:

1. 2,5 mL de solução de cobalto (II) (3 x 834 µL)
2. 2,5 mL de solução de sal de Graham (3 x 834 µL)
3. 45 mL de solução de bicarbonato de sódio (completar com 3 x 834 µL)

Distribuam 5–10 mL da solução de trabalho em quatro tubos FALCON de 50 mL, um para cada grupo.
Esta solução deve ser armazenada à temperatura ambiente no escuro.

Grupo	Número da Estirpe	Designação da Estirpe	Vetor Plasmídeo
1	µ1886	CENPK111-32D	pTA1 (vetor vazio)
2	"	"	"
3	µ1885	"	pTA1_TDH3_ScCTT1_PGI1
4	"	"	"

1. Cada grupo (G1, G2, G3 e G4) deve retirar 1 mL da cultura indicada na tabela acima para um tubo Eppendorf vazio de 1,5 mL.
2. Centrifuguem 🌀 a cultura durante 20 segundos numa microcentrífuga.
3. Removam o sobrenadante com uma pipeta P1000.
4. Adicionem 1 mL de tampão fosfato 5 mM.
5. Ressuspendam as células pipetando para cima e para baixo com a mesma ponta.
6. Centrifuguem 🌀 a cultura durante 20 segundos.
7. Removam o sobrenadante.
8. Adicionem 1 mL de tampão fosfato 5 mM.
9. Ressuspendam as células.
10. Transfiram 100 µL das células para um novo tubo Eppendorf.
11. Adicionem 400 µL de água destilada (dH₂O).
12. Adicionem 500 µL de etanol absoluto.
13. Misturem o conteúdo do tubo com vórtex durante ~30 segundos.
14. Incubem à temperatura ambiente durante 20 minutos no banco de trabalho.
15. Marquem nove tubos Eppendorf vazios com um marcador: **Sa, Sb, **Sc, T1a, T1b, T1c, T2a, T2b, e T2c.
16. Marquem nove cuvetes de plástico com as mesmas designações.
17. Façam uma pausa ☕ até as células estarem prontas. A temporização não é crítica.

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18. Adicionem os componentes na tabela abaixo aos tubos marcados. Os volumes estão indicados em microlitros (µL). Preparem os tubos na ordem indicada (de cima para baixo) e adicionem os componentes pela ordem especificada (da esquerda para a direita). Lembrem-se de que a reação começa com a adição de peróxido, por isso façam esta adição rapidamente para todos os tubos.

Rótulo	Amostra	Água	Células	Peróxido	Total
Sa	Standard	70	0	140	210
Sb	Standard	70	0	140	210
Sc	Standard	70	0	140	210
T1a	Teste 1a	0	70	140	210
T1b	Teste 1b	0	70	140	210
T1c	Teste 1c	0	70	140	210
T2a	Teste 2a	35	35	140	210
T2b	Teste 2b	35	35	140	210
T2c	Teste 2c	35	35	140	210

19. Incubem os tubos Eppendorf a 🌡️ 37 °C num banho-maria 🛁 durante 10 minutos. ⏱️ Este tempo é crítico!
20. Adicionem 800 µL da solução de trabalho a cada tubo.
21. Misturem invertendo os tubos.
22. Incubem à temperatura ambiente durante pelo menos 10 minutos no escuro 🌙. Guardem os tubos numa gaveta vazia do laboratório.
23. Centrifuguem 🌀 durante 20 segundos na velocidade máxima.
24. Transfiram os sobrenadantes para as cuvetes marcadas da mesma forma. Tirem uma fotografia 📷 das cuvetes com o vosso telemóvel e façam upload para o Google Photos.
25. Registem a absorbância de cada cuvete a 440 nm contra o ar. Coloquem a cuvete conforme as instruções do espectrofotómetro GENESYS20.
26. Adicionem os dados à folha de cálculo do Google.

Esta aula prática baseia-se numa combinação de métodos descritos nas seguintes publicações:

• Trawczyńska, I., & Wójcik, M. (2015). Optimization of permeabilization process of yeast cells for catalase activity using response surface methodology.
  Biotechnology, Biotechnological Equipment, 29(1), 72–77.
  Link

• Hadwan, M. H. (2018). Simple spectrophotometric assay for measuring catalase activity in biological tissues.
  BMC Biochemistry, 19(1), 7.
  Link

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• Kaplan, J. G. (1963). The reversion of catalase during growth of yeast in anaerobiosis.
  The Journal of General Physiology, 47, 103–115.
  Link

• Martins, D., & English, A. M. (2014). Catalase activity is stimulated by H(2)O(2) in rich culture medium and is required for H(2)O(2) resistance and adaptation in yeast.
  Redox Biology, 2, 308–313.
  Link

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Todos os valores de absorbância são medidos num espectrofotómetro calibrado contra o ar, sem uma cuvete (Figura 10).

A reação Standard na Figura 10 contém apenas peróxido de hidrogénio e carbonato de cobalto(II). Todo o peróxido disponível deve oxidar o cobalto(II) para cobalto(III).

As reações Teste contêm H2O2 e células. Parte do peróxido deverá ter sido consumida pela catalase nas células, pelo que o valor da absorbância a 440 nm deverá ser inferior ao da reação Standard.

$$\Delta A = \boldsymbol{S}tandard_{Abs440nm} - \boldsymbol{T}est_{Abs440nm}$$

A absorbância que deveria ter sido observada para o H₂O₂ consumido é a diferença entre a absorbância da reação Standard e a reação Teste. Espera-se uma absorbância mais elevada para o Teste 2, pois uma menor quantidade de células deve consumir menos peróxido.

Figura 9

Utiliza-se uma curva padrão (Figura 11) para calcular a concentração real das amostras. A atividade é então calculada a partir da diferença de concentração entre o Standard e a amostra, dividida pelo tempo da reação.

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Figura 10

Uma solução de peróxido de hidrogénio a 10 mM foi diluída em série (Figura 11), começando por preparar doze tubos Eppendorf com 300 µL de água destilada. Um mililitro de peróxido de hidrogénio foi transferido para o primeiro tubo. O conteúdo foi misturado pipetando 5–6 vezes, seguido de uma transferência de 1 mL para o tubo seguinte. No último tubo (12), o volume final foi 1,3 mL, enquanto nos tubos anteriores foi 300 µL. A concentração no primeiro tubo foi calculada sera 1 mL * 10 mM/1.3 mL = 7.6923 mM. O fator de diluição foi constante (1/1.3). A concentração de cada tubo foi calculada pela fórmula: $10 \times (\frac{1}{1.3})^n$ onde n = 1..12.

Figura 11

Figure 12

As medições de absorbância foram coletadas na tabela abaixo:

Tubo	Concentração (mM)	Série#1	Série#2
1	7.692	0.450	0.414
2	5.917	0.394	0.361
3	4.551	0.345	0.307
4	3.501	0.291	0.263
5	2.693	0.248	0.225
6	2.072	0.213	0.194
7	1.594	0.197	0.166
8	1.226	0.160	0.148
9	0.943	0.143	0.134
10	0.725	0.123	0.115
11	0.558	0.109	0.113
12	0.429	0.113	0.095

O protocolo especifica dois experimentos (Figura 6), Teste 1 e Teste 2, onde o último contém metade das células. Se o ensaio for linear, o Teste 1 deverá produzir o dobro da absorbância do Teste 2.

Figura 13

dH2O 4 x 40 mL

• 6.7 g/L Yeast Nitrogen Base (YNB) WITHOUT AMINO ACIDS
• 20 g/L glucose

10 x 50 mL glass culture tubes with cotton stopper or aluminium cap

25 mL Ethanol 95-99% (2 courses * 3 shifts * 4 groups * 0.5 mL = 12 mL)

Six empty new FALCON tubes 50 mL

This buffer can be prepared by by mixing two solutions in ultrapure water:

• 100 mL 6.81 g/L KH2PO4
• 100 mL 8.90 g/L K2HPO4

Prepared by dissolving 24 g (MW 84.01 g/mol) in 300 ml ultrapure water. This solution should be stored at room temperature.

Prepared by dissolving 0.51 g of Co(NO3)2 x 6H2O in 25 ml of distilled water. This solution should be stored at room temperature in the dark.

Prepared by dissolving 0.25 g of (NaPO3)6 in 25 ml of distilled water. This solution should be stored at room temperature.

• Eppendorf tubes 1.5 mL (new, not sterile)
• Blue tips
• Yellow tips
• Plastic cuvettes

• 37 °C water bath
• boat for cuvettes
• microcentrifuge
• vortex
• P1000 pipettes
• P200 pipettes

Estriar as duas estirpes abaixo em meio sólido YPD e incubar a 30 °C por ~48 h.

Número da Estirpe	Designação da Estirpe	Vetor Plasmídeo		caixa	pos
µ1886	CENPK111-32D	pTA1	vetor vazio	Björn12	35
µ1885	"	pTA1_TDH3_ScCTT1_PGI1	vetor de expressão CTT1	""	34

Inocular dois tubos de vidro de 50 mL com ~5 mL de meio SD e incubar a 30 °C por ~48 h.
Rotular os tubos 5 e 6 para µ1885 e µ1886, respetivamente. Estas culturas podem ser mantidas a 4-8°C no frigorífico durante ~3-4 semanas.

Esta etapa deve ser realizada na manhã do dia anterior à aula. Inocular dois tubos de vidro de 50 mL com 5-10 mL do mesmo meio usando 100 µL de cada pré-cultura. Rotular os tubos com 5 ou 6.

• 6,7 g/L de Base de Nitrogénio de Levedura (YNB) SEM AMINOÁCIDOS
• 20 g/L de glicose

10 x 50 mL tubos de cultura de vidro com rolha de algodão ou tampa de alumínio

25 mL de Etanol 95-99% (2 cursos * 3 turnos * 4 grupos * 0,5 mL = 12 mL)

Seis tubos FALCON novos e vazios de 50 mL

Este tampão pode ser preparado misturando duas soluções em água ultrapura:

• 100 mL de 6,81 g/L de KH2PO4
• 150 mL de 8,90 g/L de Na2HPO4

Preparada dissolvendo 24 g (PM 84,01 g/mol) em 300 mL de água ultrapura. Esta solução deve ser armazenada à temperatura ambiente.

Preparada dissolvendo 0,51 g de Co(NO3)2 x 6H2O em 25 mL de água destilada. Esta solução deve ser armazenada à temperatura ambiente no escuro.

Preparada dissolvendo 0,25 g de (NaPO3)6 em 25 mL de água destilada. Esta solução deve ser armazenada à temperatura ambiente.

• Tubos Eppendorf de 1,5 mL (novos, não estéreis)
• Pontas azuis
• Pontas amarelas
• Cuvetes de plástico

• Banho-maria a 37 °C
• Barcos para tubos
• Microcentrífuga
• Vórtex
• Pipetas P1000
• Pipetas P200