Glucose Consumption pt - MetabolicEngineeringGroupCBMA/MetabolicEngineeringGroupCBMA.github.io GitHub Wiki

A glicose é a principal fonte de energia na maioria dos organismos, ocupando uma posição central no metabolismo. A glicólise é uma sequência de reações enzimáticas que ocorrem no citoplasma das células e permite a clivagem das moléculas de glicose, resultando em duas moléculas de piruvato e uma pequena quantidade de ATP e equivalentes redutores. O destino da molécula de piruvato depende do organismo e determina a quantidade de ATP que pode ser obtida. O piruvato pode seguir três caminhos metabólicos diferentes, dependendo do organismo e das condições ambientais.

Sob condições aeróbicas em mamíferos, o piruvato é transformado em Acetil-CoA e direcionado para a mitocôndria.

O Acetil-CoA é oxidado a CO₂ no ciclo do ácido cítrico, com a produção de poder redutor na forma de NADH e FADH₂ e pequenas quantidades de GTP.

A energia potencial dos elétrons no NADH e FADH₂ é utilizada para bombear prótons para fora da mitocôndria e, eventualmente, usada para reduzir O₂ a água.

Em condições anaeróbicas, o piruvato é convertido em ácido láctico, aumentando os níveis de ácido láctico no sangue.

As leveduras são organismos unicelulares amplamente utilizados em processos industriais. Saccharomyces cerevisiae é responsável pela fermentação durante a produção de bebidas fermentadas, como vinho e cerveja, bem como na panificação.

Sob condições anaeróbicas, essas leveduras podem metabolizar glicose, desviando o piruvato para a formação de etanol e dióxido de carbono em um processo chamado fermentação alcoólica.

O piruvato pode ser diretamente convertido em acetil-CoA pelo complexo piruvato desidrogenase (PDH) na mitocôndria.

Alternativamente, o piruvato também pode ser convertido em acetil-CoA no citosol através da via de desvio do PDH, passando por acetaldeído e acetato.

Em leveduras, este desvio requer a atividade de três enzimas diferentes:

1. PDC (piruvato descarboxilase), que converte piruvato em acetaldeído
2. ALD (acetaldeído desidrogenase), que converte acetaldeído em acetato
3. ACS (acetil-CoA sintetase), que converte acetato em acetil-CoA

Este acetil-CoA pode então ser transportado para a mitocôndria via o sistema carnitina acetiltransferase.

Em concentrações elevadas de glicose, a taxa glicolítica aumenta, formando mais piruvato, saturando o desvio do PDH e redirecionando o fluxo de carbono para a produção de etanol, iniciando a fermentação.

As vias do metabolismo central do carbono são essencialmente idênticas entre diferentes espécies de leveduras. No entanto, os mecanismos de absorção de nutrientes, as isoenzimas envolvidas e a regulação dos processos respiratórios e fermentativos diferem substancialmente.

Para S. cerevisiae, concentrações elevadas de glicose aumentam a atividade da piruvato descarboxilase de 3 a 4 vezes e diminuem a atividade da acetaldeído desidrogenase, favorecendo a fermentação alcoólica e, portanto, a formação de etanol. Por outro lado, em concentrações baixas de glicose, o piruvato é principalmente convertido em acetil-CoA pelo complexo PDH.

O acetil-CoA formado no complexo PDH ou no desvio do PDH é a ligação entre a glicólise e o ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). A principal função do ciclo TCA é fornecer equivalentes redutores à cadeia respiratória (veja acima). No entanto, o ciclo TCA também funciona em vias biossintéticas e, como tal, pode estar parcialmente ativo mesmo em condições anaeróbicas.

As leveduras podem ser classificadas fisiologicamente de acordo com o tipo de metabolismo energético envolvido no metabolismo do açúcar:

• Não fermentativas (aeróbicas ou respiratórias)
• Obrigatoriamente fermentativas
• Facultativamente fermentativas

As leveduras não fermentativas possuem metabolismo respiratório e não conseguem realizar a fermentação alcoólica a partir da glicose (e.g. Rhodotorula glutinis, uma levedura oleaginosa famosa), enquanto leveduras obrigatoriamente fermentativas só conseguem metabolizar a glicose através da fermentação alcoólica (e.g. Piromyces).

A maioria das leveduras identificadas são facultativamente fermentativas e, dependendo das condições de crescimento, tipo e concentração de açúcar e disponibilidade de oxigênio, podem apresentar metabolismo respiratório, fermentativo ou misto.

Existem dois principais efeitos associados à aquisição de energia através do metabolismo do açúcar e/ou da disponibilidade de oxigênio em leveduras: efeitos Pasteur e Crabtree.

O efeito Pasteur refere-se à ativação da glicólise anaeróbica para atender às necessidades de ATP da célula, devido à baixa eficiência da produção de ATP pela fermentação em comparação com a respiração aeróbica. Louis Pasteur estava investigando como a levedura converte açúcares em álcool durante a fermentação. Ele percebeu que, quando o oxigênio estava presente, a levedura produzia muito menos álcool e consumia menos açúcar em comparação com quando o oxigênio estava ausente. Isso contrariava a crença prevalente de que o oxigênio era necessário para todas as formas de vida produzirem energia de forma eficiente.

O efeito Crabtree é definido como a ocorrência de fermentação alcoólica mesmo em condições aeróbicas (onde não é esperado). Em leveduras Crabtree-negativas, não há produção significativa de etanol em condições aeróbicas. Saccharomyces cerevisiae é considerada Crabtree-positiva.

Torulaspora delbrueckii é uma espécie de levedura que tem ganhado atenção devido às suas propriedades únicas e aplicações em diversos processos industriais, especialmente na produção de alimentos e bebidas. Ela é intimamente relacionada a Saccharomyces cerevisiae, mas difere significativamente em suas características metabólicas e fisiológicas. Torulaspora delbrueckii pode fermentar uma variedade de açúcares, incluindo glicose, frutose e sacarose. Torulaspora delbrueckii geralmente produz menos etanol e mais glicerol em comparação com S. cerevisiae, resultando em bebidas menos alcoólicas, tornando-a adequada para vinhos e cervejas de baixo teor alcoólico.

Nesta aula prática, avaliaremos o consumo de glicose por células de levedura Saccharomyces cerevisiae ou Torulaspora delbrueckii durante um curto período na presença ou ausência de oxigênio.

Nesta aula, serão utilizadas duas espécies diferentes de levedura: Saccharomyces cerevisiae e Torulaspora delbrueckii. Antes da aula, a suspensão de levedura foi preparada dissolvendo as respectivas células em uma solução salina tamponada (PBS) a pH 7,4.

As células de levedura serão incubadas por um curto período (até 15 min). Isso significa que não precisamos nos preocupar com a esterilidade do experimento. É importante trabalhar rapidamente.

Grupo	Condição Respiratória	Levedura	Recipiente	PBS (µL)	Glicose a 10% (µL)	Suspensão de células (µL)
1	Anaeróbico	S. cerevisiae	Placa de cultura aberta	400	80	200
2	"	T. delbrueckii	"	"	"	"
3	Aeróbico	S. cerevisiae	Tubo Eppendorf fechado (1,5 mL)	"	"	"
4	"	T. delbrueckii	"	"	"	"

1. Prepare oito tubos Eppendorf (1,5 mL) por grupo. O experimento deve ser realizado em duplicado.
2. Marque-os com 0, 5, 10 e 15 nas tampas. Estes são os tempos de incubação em minutos.
3. Adicione 400 µL de PBS a cada tubo.
4. Adicione 80 µL de solução de glicose a cada tubo.
5. Misture o tubo com a suspensão de células por inversão, de modo que o conteúdo fique uniformemente misturado.
6. Adicione 200 µL de suspensão de células a cada tubo Eppendorf com PBS+glicose.
7. Remova o tubo t=0 e coloque-o imediatamente no gelo.
8. Incube os seis tubos restantes no banho-maria a 37°C.
9. A cada ponto de tempo, retire um tubo do banho e coloque-o no gelo.
10. Quando a última incubação estiver concluída, centrifugue todos os tubos a >10.000 rpm por 5 minutos.
11. Transfira o sobrenadante de cada tubo para um tubo Eppendorf limpo, rotulado, e congele a -20°C.

1. Adicione 400 µL de PBS a cada um dos oito poços em duas placas de cultura abertas. O experimento deve ser realizado em duplicado.
2. Adicione 80 µL de solução de glicose a cada um dos poços.
3. Misture o tubo com a suspensão de células por inversão, de modo que o conteúdo fique uniformemente misturado.
4. Adicione 200 µL de suspensão de células a cada um dos quatro poços.
5. Remova o conteúdo do poço t=0 e adicione-o a um tubo Eppendorf, colocando este tubo imediatamente no gelo.
6. Incube as células em uma incubadora a 37°C e 120 rpm por 5, 10 e 15 minutos, respectivamente.
7. A cada ponto de tempo, retire o conteúdo de um poço e adicione-o a um tubo Eppendorf, colocando este tubo imediatamente no gelo.
8. Quando a última incubação estiver concluída, centrifugue todos os tubos a >10.000 rpm por 5 minutos.
9. Transfira o sobrenadante de cada tubo para um tubo Eppendorf limpo, rotulado, e congele a -20°C.

• 30 mL de suspensão celular de S. cerevisiae (15 g/100 mL) em PBS
• 30 mL de suspensão celular de T. delbrueckii (15 g/100 mL) em PBS

Congele 5 mL em seis tubos diferentes.

• 4 tubos FALCON com 10 mL de solução de glicose a 10%
• 4 tubos FALCON com 50 mL de PBS
• Pipetas P1000
• Pipetas P200
• Pontas azuis (não estéreis)
• Pontas amarelas (não estéreis)
• Caixa de congelamento para armazenar tubos Eppendorf com sobrenadantes
• 4 caixas de gelo
• 4 placas de cultura com 6 poços

• 24 tubos Eppendorf (2 mL)

• 100 tubos Eppendorf
• Incubadora a 37°C
• Banho-maria a 37°C
• Centrífuga Eppendorf