Nesta aula prática, utilizaremos os sobrenadantes obtidos na Aula Prática 1 e quantificaremos a glucose utilizando o método do ácido dinitrossalicílico (DNS).

O método utilizado foi descrito por Miller (1959). Este método baseia-se na formação de um complexo castanho-alaranjado pela redução do ácido 3,5-dinitrossalicílico para ácido 3-amino-5-nitrossalicílico por açúcares redutores.

Todos os monossacarídeos (Figura 1) e alguns polissacarídeos são açúcares redutores, como por exemplo:

• ✅ Glucose
• ✅ Frutose
• ✅ Galactose
• ✅ Maltose
• ✅ Lactose
• ❌ Sacarose

Um açúcar redutor possui um grupo aldeído ou ceto livre:

Figura 1

A maioria dos açúcares em forma cíclica contém um hemiacetal (Figura 2) e são redutores, uma vez que estão em equilíbrio com um grupo aldeído livre.

Figura 2

A maioria dos monossacarídeos encontra-se tanto em forma linear como cíclica (Figura 3).

Figura 3

Alguns açúcares possuem apenas acetais e, por isso, não são redutores (Figura 4).

Figura 4

Figura 5 - Um bom vídeo no YouTube sobre açúcares redutores (5 minutos)

A concentração deste complexo colorido é proporcional à concentração de açúcares redutores na amostra.

A partir de valores conhecidos de concentração de glucose, é possível construir uma curva de calibração, como mostrado na figura a seguir, que ilustra a absorbância (OD a 540 nm) em função da concentração de glucose em equivalentes de açúcar redutor.

A equação da reta obtida pela regressão linear é a seguinte:

Figura 6

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1. Cada grupo deverá preparar 4 tubos de ensaio de vidro (correspondendo aos 4 tempos de incubação utilizados na Aula Prática 1) e adicionar 0,5 mL da solução a ser analisada (amostra obtida na Aula Prática 1) e 0,5 mL da solução DNS, de acordo com a tabela seguinte:

Grupo / Bancada	Condição Experimental		Amostras (min)	Volume da Amostra	Volume de DNS
1	S. cerevisiae	aeróbica	0, 5, 10, 15	0,5 mL	0,5 mL
2	S. cerevisiae	anaeróbica	"	"	"
3	T. delbrueckii	aeróbica	"	"	"
4	T. delbrueckii	anaeróbica	"	"	"

2. Incubem durante 5 minutos em banho-maria a ferver.
3. Arrefeçam sob água corrente (torneira).
4. Adicionem 5 mL de água desionizada fria a cada tubo e misturem com vórtex.
5. Meçam a absorbância a 540 nm utilizando um espectrofotómetro. Antes da medição, preparem um branco utilizando 0,5 mL de água desionizada + 0,5 mL de DNS.
6. Calculem a concentração de açúcares redutores utilizando a fórmula fornecida na imagem anterior (esta curva de calibração foi obtida com soluções padrão de glucose de concentrações conhecidas).

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Miller, G. (1959). Use of DNS acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry. Vol. 31 (3). pp. 426-428.

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1. O método DNS é amplamente utilizado para quantificar açúcares redutores. Que outros açúcares, além da glucose, podem ser quantificados por este método? Que açúcares não podem ser quantificados?

2. Por que a glucose foi escolhida para a construção da curva de calibração? Poderia outro açúcar (como a frutose) ser utilizado para construir esta curva?

3. Com base apenas nos resultados obtidos nesta aula prática, é possível concluir algo sobre o efeito de Pasteur?

4. Explique as diferenças encontradas nos níveis de glucose quantificados pelos métodos HPLC e DNS. Quais são as vantagens de cada um?