STTT 高转移肝细胞癌外泌体S100A4通过激活STAT3促进肿瘤转移 - zhengxj1/Papers GitHub Wiki
1、外泌体的分离与鉴定以及HCC细胞的释放和吸收
使用投射电子显微镜观察了外泌体的形态和形状；纳米粒子跟踪分析发现外泌体直径在40-200nm之间，并且在6个HCC细胞系外泌体中都检测到了外泌体标志物CD63，CD9，和Alix的表达；然后使用DIO标记高转移性HCC细胞的外泌体（HMH-exo）和低转移性HCC细胞外泌体（LMH-exo），在激光扫描共焦显微镜下观察到绿色标记的HMH-exo和LMH-exo都可以被低转移性HCC细胞细胞系有效吸收（图1）。这些结果表明已经成功分离和纯化HCC来源的外泌体并且他们可以被其它HCC细胞吸收。
2、HMH-exo增强低转移性HCC细胞系的转移潜力
为了探究HCC转移时外泌体在细胞与细胞串扰中的可能作用，作者实验HMH-exo预处理低转移性的HCC细胞系。结果发现，与LMH-exo或者PBS预处理组相比，HMH-exo显著增强了低转移性HCC细胞系的转移能力；随后作者使用低转移性HCC细胞系构建了体内原位异种移植瘤模型，成瘤后使用外泌体治疗6周，最后检测肝脏肿瘤和肺转移，结果显示与其它组相比，HMH-exo组的肝脏肿瘤更大，肺转移结节更多。（图2）。这些结果表明HMH-exo可以在体内外增强低转移性HCC细胞的转移能力。
3、外泌体S100A4是HCC细胞转移潜力的关键增强子
为了探究通过HMH-exo增强HCC转移能力的关键，作者对LMH-exo和HMH-exo进行了iTRAQ质谱筛选。结果从HMH-exo中鉴定到116个显著上调和43显著下调的蛋白质；结果发现了4个蛋白家族的聚类：Apo、PSM、EEF/EIF和S100钙结合蛋白家族（图3a-b）。经过文献分析，作者主要关注了S100钙结合蛋白家族，并以其中最显著差异表达的4个蛋白为主：依次是S100A4，S100A6，S100A10，和S100A11。作者检测了这4个蛋白在5个HCC细胞系外泌体中的表达丰度，结果发现依然是S100A4的表达水平最高（图3c）。因此，初步选择S100A4进行下一步分析。
进一步检测S100A4的功能，结果显示敲除S100A4显著降低高转移性HCC细胞系的迁移和侵袭能力，过表达S100A4则显著增强低转移性HCC细胞系的迁移和侵袭能力（图3d）。然后作者收集了S100A4敲除和S100A4过表达的HCC细胞的外泌体，结果得到了类似的结论，S100A4过表达外泌体显著增强HCC细胞的迁移和侵袭，以及体内肺部转移的能力（图3e-f）。这些结果证实了外泌体S100A4具有增强HCC细胞转移潜力的功能。
4、外泌体S100A4通过STAT3磷酸化激活OPN转录
接下来探究了S100A4的作用机制，首先选择了21个肿瘤干性相关基因，然后下载了GEO数据进行相关性分析，结果显示S100A4主要和11个基因正相关（图4a）。随后检测了不同HCC细胞系中敲除和过表达S100A4后11个基因的表达水平的改变，结果显示只有OPN是S100A4的下游基因，其表达受到S100A4的调控（图4b-f）。OPN是促进HCC转移和干性的关键因子，但外泌体S100A4调节OPN的机制仍不清楚。
5. STAT3调控OPN
研究报道S100A4可以增强STAT3的磷酸化，而STAT3的磷酸化与OPN的表达是相关的，并且STAT3被预测是OPN的潜在转录因子。因此，检测了S100A4敲除和过表达后OPN表达，STAT3表达和STAT3磷酸化，结果显示OPN表达和STAT3磷酸化水平与S100A4的变化趋势一致；并且敲除STAT3后HCC细胞系中OPN表达和STAT3磷酸化被显著抑制（图5a-c）。这些结果表明S100A4可以激活STAT3磷酸化并增加OPN表达。
为了进一步探究S100A4过表达外泌体对STAT3磷酸化和OPN表达的影响，使用该外泌体预处理HCC细胞，结果显示它可以显著促进 STAT3磷酸化和OPN表达，以及S100A4的表达（图5d）。此外，在原位异种移植瘤模型中，HMH-exo显著增强了核STAT3磷酸化和细胞质OPN的表达（图5e-f）。总之，以上结果表明S100A4过表达外泌体促进低转移性HCC细胞的转移潜力，而外泌体S100A4是HCC细胞的关键增强子，其通过激活STAT3的磷酸化和上调OPN的表达实现其功能（图6a）。
6.血浆外泌体S100A4和OPN水平联合可以作为HCC患者术后的强力预后因子
在168例接受肝切除术的HCC患者中，进一步研究了血浆外泌体S100A4和OPN水平的临床意义。结果发现外泌体S100A4水平和OPN的表达显著正相关，并且外泌体S100A4低表达组患者的总体生存率和无疾病生存率要显著高于外泌体S100A4高表达组（图6b-d）。随后，基于外泌体S100A4水平和OPN水平的联合分析，将患者分为4组，结果发现双低水平S100A4和OPN组具有最好的预后，而双高组则预后最差（图6e-f）。