Review 纤维化的高分综述 - zhengxj1/Papers GitHub Wiki

长期以来，转化生长因子β（TGF-β）一直被认为与早期胚胎发育和器官发生、免疫监督、组织修复和成人体内平衡密切相关。TGF-β在纤维化和癌症中的作用是复杂的，有时甚至是相互矛盾的，根据疾病的阶段表现出抑制或促进作用。在病理条件下，过度表达的TGF-β会导致上皮-间充质转化（EMT）、细胞外基质（ECM）沉积、癌相关成纤维细胞（CAF）形成，从而导致纤维化疾病和癌症。鉴于TGF-β及其下游分子在纤维化和癌症进展中的关键作用，靶向TGF-β信号的治疗似乎是一种有前途的策略。然而，由于潜在的全身细胞毒性，TGF-β疗法的发展滞后。因此，今天带大家一起看这篇2022 Apr 23发表在Mol Cancer（IF 41+）上，题为“Targeting TGF-β signal transduction for fibrosis and cancer therapy”的高分综述。该综述总结了TGF-β的生物学过程及其在纤维化发生中的双重作用，以及TGF-β靶向治疗的临床应用。

转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β)是隶属于调节细胞生长和分化的TGF-β家族。目前发现人类组织细胞中有32个TGF-β家族蛋白，包括：10个骨形成蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP），11个生长分化因子（growth and differentiation factors，GDF），抗缪勒式管激素（AMH/MIS）、抑制素（Inhibin），激活素（Activin），Nodal及3个TGF-β等。目前发现人类组织细胞中有32个TGF-β家族蛋白，包括：10个骨形成蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP），11个生长分化因子（growth and differentiation factors，GDF），抗缪勒式管激素（AMH/MIS）、抑制素（Inhibin），激活素（Activin），Nodal及3个TGF-β等这一家族除TGF-β外，还有活化素（Activins)、Nodal、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)（又称骨形成蛋白）和生长分化因子(growth and differentiation factors, GDFs)等因子组成。TGF-β作为一种多功能多肽细胞因子，在胚胎早期发育和成人稳态中起着至关重要的作用。TGF-β的三个亚型(TGF-β I - III)仅在哺乳动物中表达，且具有独特的多功能生长因子。以下各段中，如未特别说明，TGF-β为TGF-β I。TGF-β主要以潜伏复合物的形式分泌并储存在细胞外基质(ECM)中，只有激活的TGF-β才能与TGF-β受体(TβR)复合物结合，从而发挥其生物学功能。因此，TGF-β的激活对其运作至关重要。

近年来，科学家发现TGF-β过表达引起过多的代谢障碍和功能障碍，并促进上皮-间充质转化(EMT)和ECM过度沉积，从而引起免疫功能障碍、纤维化和癌症。由于TGF-β在人类纤维化和癌症中的重要作用，抗TGF-β方法已被引入治疗这些疾病。近年来，多项临床试验证实了TGF-β靶向药物对多种肿瘤和纤维化疾病的治疗作用。靶向TGF-β药物(抗TGF-β抗体、TβR抑制剂和重组蛋白)与其他抗原[程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)、M7824、SHR-1701、JS201、TST005和COX-2 (STP705)]的联合是目前最流行的治疗策略。

TGF-β的加工

Pro-TGF-β在ECM中作为一种潜伏复合体被合成，与包含信号肽的Large N端LAP (latent -associated peptide)和C端片段对应于成熟细胞因子相关。大潜伏复合物(LLC)包括LAP、TGF-β、潜伏TGF-β结合蛋白(LTBP) 1/3和LTBP4。潜伏的TGF-β被蛋白质和酶[血栓反应蛋白1(TSP-1)、糖蛋白A为主的重复序列蛋白(GARP)、整合素（integrins）和其他TGF-β结合蛋白]激活并转化为二硫连接二聚体和同型二聚体配体。激活的TGF-β与TβR复合物或其他细胞因子相互作用，通过SMAD和/或非SMAD通路调节生物反应。

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TGF -β分泌

LAP通过两个半胱氨酸残基的二硫键与LTBPs共价结合。LTBPs是TGF-β前体蛋白折叠的启动子。此外，LTBPs对潜在TGF-β的定位和激活至关重要。LAP被Furin酶切割，其中LTBPs被认为是的主要激活剂。尽管LAP从C端部分被切割，但它仍然与成熟细胞因子TGF-β非共价相关。

TGF-β的定位和激活

通常，LLC通过LTBP独特的生物学特性分泌到ECM, LTBP与细胞外基质纤维（extracellular matrix fibers）相互作用，使TGF-β保持非活性形式。最近的一项研究表明，pro-TGF-βI的晶体是环形复合物。当LAP-surrounded TGF-β单体在细胞支架压力下被释放时，活性细胞因子与TβR相互作用以调节细胞反应(图1)。这种力依赖的激活需要解开名为“straitjacket”元件的前结构域。

酶激活

除了通过非蛋白水解机制激活潜伏的TGF-β外，蛋白酶也参与了TGF-β的激活。此外，这些蛋白酶又分为含糖苷酶(N-甘聚糖酶和神经氨酸酶)和丝氨酸蛋白酶(纤溶酶、组织蛋白酶D和基质金属蛋白酶)。总之，在细胞质基质中，TGF-β可被多种蛋白酶、整合素和其他TGF-β结合蛋白在不同的细胞类型、组织和疾病环境中激活。值得注意的是，潜伏TGF-β的蛋白水解切割位点暗示了蛋白酶如何切割LAP潜伏套索的机制。例如，血浆激肽释放酶（PLK）切割潜伏TGF-β的R58和L59之间的残基。在分子水平上研究TGF-β的活化过程有助于靶向TGF-β治疗。

被原纤蛋白（fibrillin）调节

LTBPs在结构上与另一种称为fibrillins的蛋白质家族相关并在物理上结合。Fibrillin 1可作为TGF-β信号通路的抑制剂，但它是否更直接地控制fibrillin-LTBP相互作用或稳定抑制潜伏LLC蛋白水解激活仍需探索。

科学家先前提出，当与整合素结合基序精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）结合时，Fibrillin 1可以呈现在表面暴露的环上。而其余remaining fibrillins对TGF-β的激活几乎没有抑制作用。许多研究表明，fibrillin-2的表达主要局限于发育中的胎儿组织，而fibrillin-1的表达在整个成年期都会持续。此外，fibrillin-1与相关分子一起掩盖fibrillin-2表位以阻断其生物活性。因此，fibrillin-1表现出较强的抗TGF -β活性。其余remaining fibrillins对TGF-β激活的抑制作用较小。

值得注意的是，最近的一项研究表明，当局部fibrillin-1下调时，fibrillin-2分子暴露在肿瘤内皮中，其阻断TGF-β的能力较低。Heena Kumra等人认为，fibrillin-4可能通过调节LTBP-4基质组装来影响TGF-β信号。

TGF-β活化被GARP调控

最近的证据表明，调节性T细胞(Tregs)可以为通过GARP结合αVβ8整合素促进潜伏TGF-β转化(图1)。与LTBPs在ECM中大量存在不同，GARP仅保留在表达Foxp3的Tregs表面。

目前普遍认为αVβ8整合素参与GARP/TGF-β复合物的激活，但其具体机制存在争议。一些科学家指出，α v β8介导的TGF-β激活不需要细胞支架力。也有人认为GARP调控TGF-β激活需要成熟TGF-β的释放和扩散。此外，他们发现成熟的TGF-β信号参与了潜伏TGF-β，这表明αvβ8介导的TGF-β激活可能形成一个大的多组分细胞-细胞蛋白复合物，诱导SMAD依赖通路。无论GARP诱导TGF-β激活的机制如何，靶向GARP是避免TGF-β激活的方法之一。

TGF-β被整合素激活

整合素家族成员参与TGF-β的识别和激活。此外，整合素介导的TGF-β激活在免疫系统(整合素αvβ6和αvβ8)、肿瘤发生和成纤维细胞中至关重要。整合素αvβ6和αvβ8通过结合RGD肽（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，可识别整合素）调节TGF-β信号，依赖于肌动蛋白细胞骨架产生的张力。除了整合素αvβ6和αvβ8外，整合素α8β1、α5β1和αIIβ3也能识别TGF-β LAP区域的RGD位点。这种RGD识别机制调节TGF-β家族的生长和分化因子，以维持形态发生和稳态。

然而，仅整合素的存在不足以激活TGF-β。大量研究表明，肌动蛋白-肌球蛋白收缩和机械变形对TGF-β活化非常重要。此外，科学家普遍认为，通过物理力，肌动蛋白细胞支架收缩先于整合素介导的TGF-β激活产生。此外，最近的一项研究表明，整合素αvβ6及其整个外膜域激活GARP来定位潜伏的TGF-β，而不需要成熟TGF-β的释放和扩散。

活化TGF-β传导的低亲和异聚体受体复合体(tβR I和tβR II)刺激下游不同信号通路(SMAD通路和no-SMAD通路)调节context依赖性转录(图2)。在不同生理和病理条件下，不同的激酶或信号通路调节SMAD通路调节蛋白表达。 image

SMAD途径

SMAD是一种经典信号传导途径，TGF-β与TβR II型受体结合，II型受体招募并磷酸化TβR I型受体，TβR II和TβR I形成异聚体，活化的TβR I型受体再磷酸化受体-SMAD蛋白（R-SMAD），这些蛋白再与Co-SMAD/SMAD4结合，形成三聚体复合物。然后，三聚体复合物作为转录因子移至并聚集在细胞核中，调节靶基因表达。

除了受其他信号通路或细胞因子调控外，TGF-β信号传导也是自动化的。SMAD信号的下游因子，特别是Smad2/Smad3，被认为是TGF-β信号在组织纤维化和肿瘤发生中的关键调节因子。例如，smad3诱导TSP-4上调，TSP-4通过介导TGF-β诱导的血管生成刺激肿瘤生长。同时，Smad6和Smad7被认为是改善TGF-β介导的纤维化和肿瘤发生的负调控因子。

No-SMAD途径

TGF-β通过磷酸化、乙酰化、SUMO化、泛素化和蛋白-蛋白相互作用激活的所有通路和下游级联被统称为非SMAD信号通路。这些相互作用介导TGF-β和/或其相关因子的细胞内反应被统称为非SMAD信号通路。成熟TGF-β激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、细胞外信号调节激酶1/2 (Erk1/2)通路、Rho样信号通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/AKT通路、c-Jun氨基端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38/MAPK)信号通路。Erk信号通路对于成年生物体的胚胎发育至关重要。例如，它影响胚胎，特别是神经的发育，EMT促进老年疾病的纤维化和癌症转移(Fig. 3)。越来越多的证据表明，多种TGF-β信号通路响应与核心通路组分(包括配体、受体、SMADs和转录因子)的组合使用有关，通过与其他通路交叉作用来调控靶基因转录。 image

TGF-β在纤维化中的作用

纤维化是指器官实质细胞坏死，ECM过度沉积，引起结缔组织增生、纤维化，甚至明显产生器官硬化的病理过程。此外，纤维化通常伴随着成纤维细胞转变为肌成纤维细胞，甚至是癌症相关成纤维细胞（CAFs）。正常的成纤维细胞是癌旁间质（paraneoplastic stroma）的组成部分，在支持组织常驻细胞的内稳态和定义器官的结构方面是至关重要的。一些细胞因子和趋化因子(miR-214，IL-1，α-SMA，整合素β-1)和信号通路(EGFR, Wnt/β-catenin, Hippo, TGF-β和JAK/STAT级联)将正常成纤维细胞重新编程为CAFs。然而，CAFs转化的机制很少为人所知。

TGF-β I- III均具有成纤维作用，在氨基酸水平上具有70-82%的同源性。TGF-β I被认为是肝、肾和肺纤维化的主要因素，通过典型和非典型信号通路。通常，细胞因子TGF-β在组织损伤、炎症和伤口愈合中上调。伤口的长期收缩状态有助于加速ECM蛋白的表达。异常调控的TGF-β信号通路通过过度ECM沉积促进病理性纤维化和肿瘤发生(图4)。ECM的异常积累通过将SMAD4、BRAF、TP53突变和MYC扩增联系起来，触发纤维化和免疫抑制过程，并有助于癌症相关成纤维细胞(CAF)表型。科学家发现抑制TGF-β信号通路及其下游信号通路可显著减少纤维化。 image 在病理条件下，包括巨噬细胞、上皮细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、内皮细胞等多种不同类型的细胞可以通过SMAD和非SMAD途径产生和分泌更多的TGF-β介导成纤维细胞。虽然TGF-β在促进纤维化中起着至关重要的作用，但临床上很少有抗纤维化治疗靶向TGF-β。

TGF-β在肝纤维化中的作用

急性和慢性肝损伤促进各种类型细胞的TGF-β的过度表达和ECM中TGF-β的激活。激活TGF-β促进胶原酶沉积和EMT诱导成纤维细胞间充质转化和肝星状细胞（Hepatic stellate cells，HSCs）活化。此外，肝损伤可直接导致TGF-β升高。肝星状细胞(Hepatic stellate cells)转变为肝细胞癌(HCC)细胞。激活的HSCs细胞表达α-SMA，但不含lipid droplets。此外，它们产生肌成纤维细胞(MFBs)，这是胶原蛋白和其他ECM蛋白的主要生产者。

在肝纤维化过程中，肝ECM的组成发生变化，并与TGF-β信号通路中的因子相互作用，调节肝纤维化。例如，SMAD2的破坏和SMAD3的组成促进II型胶原向I型和III型胶原的转录。同时，Smad2/3的磷酸化也促进MMP1、α-SMA和I型胶原蛋白的加速，导致赖氨酸氧化酶样1 (LOXL1)的过表达，促进肝纤维化。除了SMAD途径外，TGF-β也通过非SMAD途径(MAPK、ERK、p38和JNK途径)促进HSC激活。例如，活化的TGF-β通过p38和MAPK信号通路增加了kindlin-2的表达，过表达的kindlin-2通过上调Smad2和Smad3的磷酸化正反馈TGF-β通路。

鉴于TGF-β在肝纤维化中的重要作用，基线TGF-β一直被视为预后指标的生物标志物。然而，近年来靶向TGF-β治疗HCC的临床试验很少。这可能是因为TGF-β级联失调并不是HCC发生的主要因素。Galunisertib是TβR I的一种小分子选择性抑制剂，与索拉非尼联合使用可延长患者的总生存期。然而，值得注意的是，并不是所有的联合药物治疗都有助于改善HCC (NCT00557856)。

TGF-β在肾纤维化中的作用

强有力的证据表明TGF-β是肾纤维化的一个公认的中心介质。TGF-β可促进进展性慢性肾病(CKD)中ECM蛋白的积累。与肝纤维化类似，肾纤维化的发展也是通过表型的可塑性过程和迁移以及上皮细胞的侵袭完成的，其中TGF-β起着核心作用。TGF-β通过调控细胞凋亡、激活ECM合成和通过抑制金属蛋白酶抑制ECM降解，来导致进行性人类肾脏疾病。TGF-β还可以激活成纤维细胞，通过SMAD或非SMAD途径直接或间接将其他细胞类型转化为成纤维细胞型细胞。此外，TGF-β可直接作用于系膜细胞和成纤维细胞，调控细胞增殖、迁移和活化。TGF-β还介导ECM中原纤维化分子的积累。纤维化前分子包含胶原蛋白、纤维连接蛋白和纤溶酶原激活物抑制物-1 (PAI-1)。相反，过表达的TGF-β间接阻止纤维化。最近的一项研究表明，TGF-β刺激的人小管上皮细胞和纤维化肾脏表达TGF-β/ smad3相互作用的长非编码RNA (lnc-TSI)拮抗肾纤维化。

多种药物，包括单克隆抗体(FG-3019, FG-4019)、siRNA (RXI-109, OLX-101, OLX-201)、多肽(BLR-100/BLR-200)和反义寡核苷酸在内，正在进行临床试验，其他临床前研究正在试图研究更有效的靶点和治疗方法。此外，肝细胞生长因子(HGF)、BMP-7、SMAD7和lnc-TSI也可以作为抗纤维化靶点。迄今为止，科学家已经确定了TGF-β诱导的肾纤维化的多个治疗靶点，包括microRNAs、蛋白质、基因和转录因子。例如，破坏重组信号结合蛋白-jκ(RBP-Jκ)可以阻断Notch信号，调节骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMDMs)来减弱TGF-β诱导的肾纤维化。含有21-24个核苷酸的MicroRNAs (miRNAs) (miR-34a、miR-30c、miR21、miR29、miR-101a、miR-34a等)已被证明通过TGF-β信号通路在肾纤维化调控中发挥重要作用。Zhao等人发现miR-30c抑制小管上皮细胞的Snail 1-TGF-β轴以减弱EMT，这与paricalcitol类似。

TGF-β在肺纤维化中的作用

特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种慢性纤维化肺病，表现为外围向中心进展，特征性影像学表现，不可逆的结构改变和组织硬化。IPF中的肺泡上皮细胞(AECs)和成纤维细胞产生异常的ECM与TGF-β信号通路有关。TGF-β主要来源于肺泡巨噬细胞和组织转化的AECs，在IPF中受持续升高的机械张力驱动。科学家在IPF中发现了上调的成熟TGF-β和SMAD3、SMAD4、CTGF，以及下调的SMAD7。通过对纤维化发育和谷氨酸代谢的研究，科学家发现表观遗传和转录过程之间的联系几乎是TGF-β依赖的方式。除了α-SMA外，TGF-β-induced整合素、基质蛋白酶、蛋白酶抑制剂、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和小GTPase的调控因子也参与细胞- ECM相互作用。同时，TGF-β不仅能抑制抗纤维化分子的产生，还能诱导血清KL6/mucin 1 (MUC1)激活。

TGF-β是IPF中关键的促纤维化因子，但由于其多效性，抑制TGF-β会引起多种副作用。虽然临床试验未报道，但是一些TβRI激酶抑制剂在高剂量给药时显示出心脏毒性和皮肤毒性。因此，寻找TGF-β信号通路下游效应因子似乎是一个新的研究方向。长链非编码RNA如RNA H19X、DNM3OS，以及包括199a-5p、miR-199-3p和miR-214-3p在内的miRNAs都在TGF-β介导的肺纤维化的起着重要作用。DNM3OS是TGF-β诱导肺纤维化的成纤维细胞特异性关键下游效应因子，干扰其可能提供新的有效治疗靶点。此外，TGF-β与骨膜蛋白相互作用，通过αVβ3/β5-Smad3途径促进肺纤维化，整合素低分子抑制剂CP4715可使其减弱。

TGF-β靶向治疗的临床应用

证据表明，靶向TGF-β级联具有治疗纤维化和癌症患者的潜力。许多靶向TGF-β的抗癌和抗纤维化药物干预已经经历了临床前和临床阶段。TGF-β靶向药物主要分为中和抗体、小分子TGF-β抑制剂、配体陷阱、反义寡核苷酸和疫苗。

尽管TGF-β靶向药物在部分临床前动物研究中显示出令人鼓舞的潜力，但这些药物后续的临床试验结果似乎令人失望。由于TGF-β的全身性作用以及癌症和纤维化形成的复杂性，TGF-β抑制策略在纤维化患者中的应用具有挑战性。首先，虽然TGF-β级联通常被激活，有助于病理过程，但TGF-β的生理功能不可忽视。因此，TGF-β的广泛缺陷可能导致正常生理过程的干扰，应谨慎对待。其次，TGF-β调节广泛的信号级联促进纤维化和癌症，这增加了治疗的难度和复杂性。探索每种疾病的下游TGF-β激活因子是必要的。第三，尽管TGF-β在纤维化和肿瘤发生中起关键作用，但疾病的发生和发展是多因素的。靶向TGF-β治疗与其他传统疗法的联合治疗策略有待进一步研究，以达到理想的治疗效果。