骨骼发育和骨稳态依赖于破骨细胞对旧骨或受损骨的吸收和成骨细胞形成新骨之间的平衡。这种紧密耦合过程的不平衡可能导致诸如骨质疏松症和自发性骨折等疾病。骨畸形和骨量减少可能是骨形成减少、骨吸收增加或两者兼而有之的结果。一些数据表明，STAT3失活导致的骨质疏松可能与破骨细胞活性增加有关。因此，可以抑制破骨细胞活性和骨吸收的双膦酸盐被用来治疗由STAT3突变引起的继发性骨质疏松症。然而，临床研究表明，虽然双膦酸盐增加了骨密度，但双膦酸盐并不能有效降低患者病理性骨折的发生率。此外，AD-HIES患者颅面骨异常的治疗策略鲜有报道。为了解决这一临床难题，开发新的治疗思路和方法，必须进一步阐明STAT3失活引起的骨发育畸形的发病机制及其潜在机制。
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图1：已有报道表明AD-HIES相关性骨质疏松症可能与异常骨吸收有关。因此，研究人员首先通过杂交建立了破骨细胞特异性的STAT3基因敲除小鼠模型。Western blotting证实STAT3在敲基因小鼠骨髓巨噬细胞(BMMs)中表达降低。敲基因小鼠的体型大小也没有明显的改变。使用阿尔新蓝和茜素红S染色可以看到敲基因鼠没有显示出任何发育性骨畸形。以上结果证实，去除破骨细胞中的STAT3基因不会导致AD-HIES样骨畸形。
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图2：接下来构建的是成骨细胞特异性的STAT3缺失的小鼠模型，在该模型中，Cre的表达主要限于成骨前体细胞首先Western blot证实了敲基因小鼠BMSCs中STAT3的缺失。体型上来看，8周龄的敲基因小鼠与其对照相比更小。阿尔新蓝和茜素红S染色显示敲基因新生小鼠骨骼有缺陷，包括颅骨矿化不足和锁骨发育不良。此外，G图对4周龄的小鼠进行了microCT分析。与对照组小鼠相比，敲基因小鼠的头骨不仅表现出形态畸形，而且还出现明显的低骨化，表现为明显的孔隙，骨体积(BV/Tv)、骨小梁厚度(Tb.Th.)、和骨小梁数目(Tb.N.)减少，皮质厚度(Ct.Th.)显著降低，但小梁间距(Tb.sp.)增加。综上所述，成骨前体细胞中STAT3的缺失导致了AD-HIES相关的骨骼畸形，如头面部畸形和骨质疏松。
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图3：第三部分构建成骨细胞系特异性Stat3缺陷小鼠，这个基因缺陷在于在颅面间充质的和整个早期肢芽间充质中。Western blot证实STAT3在BMSCs中减少。8周龄的敲基因小鼠与其对照鼠相比体型更小。阿尔新蓝和茜素红S染色显示，敲基因小鼠的骨骼存在缺陷和畸形。值得注意的是，敲基因小鼠有自发性骨折，类似于在AD-HIES患者中观察到的自发性骨折。因此，两种成骨细胞特异性敲基因小鼠都模拟出了AD-HIES患者的骨表型，包括颅面发育不良、骨质疏松和自发性骨折。这表明是成骨细胞而不是破骨细胞中的STAT3缺失导致了AD-HIES相关的骨缺损。
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图4：小鼠股骨TRAP染色结果显示敲基因小鼠的TRAP阳性破骨细胞数量减少，排除了成骨细胞特异性Stat3缺陷小鼠的骨丢失是由骨吸收增加引起的可能性。接下来，钙黄绿素-茜素红S双标记法分析了敲基因小鼠的成骨能力。发现其骨形成活性降低。与成骨和骨形成率降低相一致的是，1型胶原和骨钙素在敲基因小鼠体内成骨细胞中的表达减少。此外，成熟骨桥蛋白(OPN)阳性成骨细胞的数量减少。从敲基因小鼠和对照仔鼠的骨髓中分离出原代BMSCs。敲基因BMSCs成骨分化能力下降，ALP活性明显降低，矿化程度降低。成骨基因如Runx2、ALP、Col1a1、OCN和BSP的mRNA水平也有相应的下降。由于敲基因小鼠有严重的骨骼畸形，为了排除发育差异，在体外用腺病毒转染的方式敲除Stat3。与上述一致，体外BMSCs中STAT3的缺失也导致成骨细胞分化降低，表现为碱性磷酸酶(ALP)活性和矿化的降低，以及成骨标志物基因表达的下降。综上所述，这些结果表明STAT3是成骨分化所必需的。
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图5：小鼠颅骨提取总RNA测序。总体而言，敲基因中有2459个基因下调>1.5倍，有231个基因上调>1.5倍。对显著下调的基因集进行 GO分析表明，这些基因包括了与骨化、成骨细胞分化和骨骼系统发育相关的基因。热图显示成骨细胞相关基因表达下调，如Dlx5、SP7、Fgf9、Cbfb、Ibsp和Pth1r。成骨细胞分化的转录网络中，Dlx5、Runx2和SP7具有重要作用。PCR证实Dlx5在敲基因小鼠中的表达下调。然后，对敲基因小鼠的股骨远端免疫组化染色显示DLX5阳性成骨细胞减少。利用慢病毒(Lv-DLX5)在敲基因BMSCs中过表达DLX5。DLX5过表达可以部分恢复受损的成骨细胞分化和敲基因BMSCs的骨化，表现为ALP活性和钙化结节增加，成骨细胞标志基因，如Runx2、ALP、Col1a1和OCN的表达增加。以上结果提示，STAT3通过调控DLX5的表达参与成骨细胞的分化和成骨。
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图6：接下来进一步研究STAT3调控DLX5表达的机制。首先Dlx5的启动子发现了两个潜在的STAT3结合位点。免疫沉淀时，STAT3与Dlx5的启动子结合。STAT3和活性的STAT3都可以促进Dlx5启动子的活性。然而，STAT3的显性负突变对Dlx5启动子的活性几乎没有影响，表明STAT3的活性对促进Dlx5的转录起关键作用。此外，STAT3结合位点的突变降低了STAT3对Dlx5启动子活性的影响，表明Dlx5启动子上的两个STAT3结合位点对其转录是必不可少的。这些结果表明，STAT3通过直接调节其启动子活性来驱动Dlx5的转录。以前有研究表明，Msx1和Dlx5协同调节颅面发育，Msx通过与其启动子结合，对Dlx5的转录起关键作用。免疫共沉淀试验表明STAT3与Msx1有关。Msx1提高了Dlx5启动子的活性，而STAT3可以进一步促进Msx1驱动的Dlx5启动子的活性。此外，STAT3结合位点的突变阻断了STAT3和Msx1对Dlx5启动子活性的协同作用。已有研究报道AD-HIEs疾病的STAT3突变主要位于DBD(42%)和SH2结构域(40%)，其中最常见的突变分别是外显子13的R382Q/W和外显子21的V637M。与WT组相比，STAT3突变组的Dlx5启动子活性降低。虽然STAT3与Msx1联合可以协同促进Dlx5启动子的活性，但这种与Msx1的协同作用在STAT3突变组中明显降低。
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图7：在5周龄小鼠中诱导STAT3的缺失。然后对股骨进行了Micro-CT分析发现，与对照小鼠相比，敲基因小鼠的骨小梁发生了显著的骨质疏松，表现为Bv/Tv、Tb.Th、Tb.N降低和Tb.Sp增加，骨形成活性降低。这些数据表明，STAT3在调节骨骼发育和维持骨内稳态方面起着关键作用。
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图8：经典的抑制剂AG490被报道能抑制STAT3的磷酸化和活性。与对照组相比，AG490可以抑制BMSCs的成骨分化，表现为ALP活性和基质矿化显著降低。此外，AG490处理组的成骨基因如Runx2、Dlx5、Col1a1、OCN和BSP的mRNA水平降低。对4周龄小鼠每天腹腔注射5 mg/kg的AG490，连续5周来进行给药。microCT分析发现，与对照组相比，治疗组小鼠的骨量减少，表现为Bv/Tv和Tb.Th的降低。AG490也减少了小鼠的骨形成。
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图9：AD-HIES是由STAT3杂合性和功能缺失突变引起的，因此，条件STAT3杂合性缺失小鼠可能适合于从功能上模拟AD-HIES患者的STAT3突变状态，并进行药理学研究。首先，从4周龄的杂合敲基因小鼠和对照小鼠中分离出骨髓间充质干细胞，用STAT3的激动剂Colivelin诱导其成骨分化。Western blotting分析证实，治疗组的STAT3磷酸化水平均升高。ALP活性和茜素红S染色显示，Colivelin能促进BMSCs的成骨分化，并能挽救敲基因BMSCs分化能力受损的状态。这与成骨基因的mRNA水平一致，如Dlx5、Runx2、ALP、Col1a1和BSP。接下来，隔天给1周龄的敲基因小鼠腹腔注射Colivelin，连续3周。小鼠部分获救，表现为Bv/Tv、Tb.Th、Tb.N升高，Tb.Sp降低。此外，钙黄绿素-茜素红S双标记法表明，Colivelin促进了敲基因小鼠的骨小梁形成。这一部分证明Colivelin可促进成骨细胞分化，部分挽救条件性STAT3杂合缺失小鼠的骨丢失。
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图10：最后使用尾部悬吊模型来模拟由于微重力造成的骨丢失。microCT分析发现尾部悬吊导致股骨骨丢失，表现为BV/Tv、Tb.N和Ct.Th降低，Tb.Sp增加。这种骨丢失可以被Colivelin部分挽救，Colivelin组的BV/Tv和Tb.N增加。钙黄素-茜素红S双标记进一步分析表明，Colivelin促进了尾部悬吊小鼠的骨形成。这些结果证实了STAT3活性的药理调节在体外可以调节成骨细胞的分化，在体内可以调节骨代谢，提示STAT3可能是通过调节成骨作用来治疗AD-HIES相关性骨缺损和其他骨疾病的合适的药理靶点。