ST 揭示了与免疫疗法疗效相关的 TIB 微环境结构

为了探索 ICB 治疗下 TME 的结构异质性，研究者对 8 名接受抗 PD-1 治疗的 HCC 患者（无反应者，n = 5；有反应者，n = 3）的肿瘤切片和邻近的正常组织切片（n = 3）进行了 ST。1 号和 5 号患者的肿瘤组织与邻近的正常组织配对（图 1A）。经过质量控制，根据无偏聚类和斑点特征，相邻正常组织的斑点被分为 HP 和 ADH1B 高表达的肝细胞，RGS5 和 MYH11 高表达的肌母细胞/过继细胞，PTPRC、CD3D、CD79A 和 COL1A1 高表达的免疫/成纤维细胞，或者 FXYD2 和KRT7 高表达的胆管细胞。肿瘤斑点分为肝细胞、免疫/成纤维细胞、肌成纤维细胞/周细胞、表达SPP1、CD68、LUM和TIMP1的SPP1+巨噬细胞/CAFs以及表达AFP和APOA2的恶性肝细胞（图 1B-G ）。 研究者无法区分 CAFs 和SPP1 巨噬细胞，它们在同一斑点上最多聚集了 10 个细胞，表明这两种细胞类型之间存在物理互作。有趣的是，在 ICB 无反应者（图 1C ）中，肿瘤细胞周围的 SPP1 巨噬细胞/CAF 簇形成了 TIB 结构，但在反应者中没有（图 1F ）观察到。SPP1 巨噬细胞/CAF 斑点在肿瘤中特异性地富集，而且 ICB 非反应者的比例高于反应者（图 1H-I）。Bayespace 增强的空间数据显示，SPP1 高表达区域在非应答者中高度表达 CD68 和 COL1A1，但在相邻的正常组织或应答者中不表达（图 1J ）。此外，多重免疫组化（mIHC）染色显示，SPP1 阳性细胞和aSMA 阳性细胞在肿瘤周围非常接近，非应答者的双阳性细胞对数量明显高于应答者（图 1K-L），表明这两种细胞类型之间的潜在串扰有助于形成与免疫疗法疗效相关的 TIB 结构。

对ICB无反应的HCC配对邻近正常和肿瘤组织的单细胞转录组图谱

为了更好地了解 ICB 无反应者的 TIB 的细胞组成，研究者对从 6 名 ICB 无反应者获得的 HCC 肿瘤和邻近的正常组织进行了 scRNA-seq（图 1A 和2A）。在对 scRNA-seq 数据进行质量控制和去除双细胞后，来自 6 名患者的 83,793 个细胞被用于后续分析（图 2A）。研究者通过 Harmony整合了所有来自肿瘤和邻近正常组织的细胞，以校正批次效应，进行聚类分析，并使用基于标记的注释来定义主要的细胞类型，包括 T/NK 细胞、骨髓细胞、B/浆细胞、成纤维细胞、内皮细胞和肝细胞/双能细胞（图 2A,B）。在所有患者的肿瘤和邻近的正常组织中都可以找到这六种主要的细胞类型（图 2C）。值得注意的是，骨髓细胞和成纤维细胞的比例在肿瘤组织中明显增加（图 2C）。 肿瘤组织和邻近正常组织之间浸润细胞类型的差异表明，TME 的动态重塑在非反应性 HCC 中起重要作用（图 2D-G ）。

SPP1 巨噬细胞在有 TIB 结构的肿瘤组织中聚集

为了进一步探索具有 TIB 结构的 ICB 无反应者的骨髓细胞的异质性，研究者应用特异性标记物将邻近正常组织中的3,034个细胞和肿瘤中的7,978个细胞分为 12 个亚型，包括具有 C1QA 和 CD68 表达的五种亚型的巨噬细胞（SPP1 巨噬细胞、FOLR2 巨噬细胞、CXCL10巨噬细胞、CCL3L1 巨噬细胞、增殖型巨噬细胞）、两种具有 CD14 表达的单核细胞亚型（经典单核细胞、促炎性单核细胞）、具有 CSF3R 表达的中性粒细胞、三种亚型的 DCs（DC1、DC2、浆细胞 DCs）和具有 TPSB2 表达的肥大细胞（图3A）。为了证明研究者的骨髓细胞聚类是正确的，研究者把研究者的数据集和Sharma等人、Zhang等人的数据通过Harmony进行了整合，SPPI 巨噬细胞与 Sharma 的数据中 TAM2 簇一致，其表达的 SPP1 和 TREM2 水平特别高，在一定程度上，这些细胞与 T 细胞相互作用，与免疫抑制有关。

SPP1 巨噬细胞是 Zhang等人的 MJ -C2- C1QA 群的一部分。FOLR2 巨噬细胞与 Sharma 等人 的 TAM1 群和 Zhang 等人 的 MJ-C3-APOE 群相似，并与 Zhang 等人的 MJ -C2-C1QA 群重叠。CCL3L1和 CXCLIO 巨噬细胞与 Sharma 等人的单核细胞源细胞和 Zhang 等人的MJ -C2- C1QA 群相似。在 Sharma 等人的数据集中，具有 SPP1 的细胞主要在 TAM2 群中，而具有 FOLR2 的细胞在 TAM1 群中。SPP1 和 FOLR2 在 MJ -C2-C1QA 群中表达，但在 Zhang等人的数据集中，MJ -C2-C1QA 群中表达 SPP1 和 FOLR2 的细胞没有重叠，表明 SPP1 巨噬细胞作为一个独立的亚型存在，可能在 TME 中发挥重要作用。然后，研究者比较了肿瘤和相邻正常组织之间的髓系细胞亚型的比例（图 3B,C ）。SPP1 巨噬细胞的比例在肿瘤中明显增加（图 3C），而浆细胞性 DC 和 DC1 集群在邻近的正常组织中富集。正如以前的报道 ，FOLR2 巨噬细胞的比例在肿瘤组织中往往高于邻近的正常组织。

SPPI 巨噬细胞与肿瘤的进展和缺氧微环境有关

为了进一步研究大型队列中亚型改变的临床相关性，研究者使用基于去卷积的工具 CIBERSORTx来预测 TCGA-CIHC 队列以及来自 Gene Expression Omnibus 的其他独立队列的微阵列数据中通过 scRNA-seq 量化的 48 种细胞类型的浸润情况。研究者发现，在 TCGA-CIHC 数据集中，SPP1巨噬细胞的浸润与邻近的正常组织相比在肿瘤中明显富集（图3D）。流式细胞仪分析显示，SPP1巨噬细胞在肿瘤组织中的浸润在无反应者中明显高于反应者（图 3E）。此外，mIHC 染色验证了 SPP1 巨噬细胞与 CD68 和 SPP1 蛋白表达的共聚焦在 HCC 肿瘤中富集（图 3F）。值得注意的是，在三个独立的队列中，HCC 和 SPP1 巨噬细胞浸润较高的患者总生存期较短（图 3G），在 TCGA- LIHC 队列（唯一有无进展生存信息的队列）中无进展生存期较短，而其他亚型的巨噬细胞没有显示出与患者预后的显著关联。研究者进一步证实SPP1蛋白在肿瘤组织中特异性表达增加(因此在邻近正常组织中不表达)，并且与HCC肿瘤微阵列预后不良相关（图3H-I)。此外，在 TCGA-CIHC 队列中，SPP1巨噬细胞的比例在晚期增加（图 3J），表明SPP1 巨噬细胞可能促进肿瘤的进展。 此外，SPP1巨噬细胞具有与其他巨噬细胞亚型不同的功能。SPP1 巨噬细胞显示出与缺氧途径相关的转录因子（如 EPAS1）的更高表达。FOLR2 巨噬细胞高度表达 FOLR2、APOE、C2 等；CXCL10 巨噬细胞高度表达 RNA 编辑酶 APOBEC3A，它被认为是促进促炎症巨噬细胞的极化；而 CCL3L1 巨噬细胞高度表达CD74、HLA-DR、HLA-DP 和 HLA-DQ，它们与抗原呈现有关。功能分析显示，糖酵解/葡萄糖生成、氧化磷酸化和 HIF-1 信号通路在SPP1 巨噬细胞中富集，而与吞噬体和抗原处理和呈现有关的基因在所有其他亚型的巨噬细胞中高度富集（图 3K）。研究者进一步发现，缺氧可以诱导 SPP1 在体外 THP-1 细胞上更高的表达（图 3L），而 SPP1 巨噬细胞的吞噬功能得分最低，这表明 SPP1 巨噬细胞确实受到缺氧的影响，促进肿瘤的发展，并抑制吞噬功能

与 TIB 结构的形成有关的 CAF 和 SPPI 巨噬细胞之间的相互作用

为了分析 TIB 的另一个组成部分 CAFs 的细胞组成，研究者将肿瘤和邻近正常组织的 scRNA-seq 数据集中的成纤维细胞细分为四个亚型（图4A），包括表达 COL1A1、COL1A2、VCAN 和 TIMP1 的 CAFs；表达 SDO3、DSTN、MYH11 和 CD9 的肌成纤维细胞；表达 RGS5 和 NDUFA4L2 的周细胞；以及表达 COLEC1O、CD14 和 HGF 的肝星形细胞（图 S5A）。然后，研究者调查了相邻的正常组织和肿瘤组织之间的成纤维细胞亚型的改变，发现 CAFs 主要在肿瘤组织中富集，而其他三种成纤维细胞亚型没有显示出明显的变化（图 4B）。CIBERSORTx 的去卷积分析显示，在 TCGA- LIHC队列中，肿瘤样本中 CAFs的浸润比例与邻近的正常组织相比明显增加（图 4C）。在 ICGC（国际癌症基因组联盟）HCC 队列中，CAFs 浸润较高的患者总生存期较短（图 4D），这表明 CAFs 在肿瘤组织中的富集可能与 HCC 患者的预后不良有关。

然后，研究者用 scRNA-seq 数据集中的 CAF 和 SPP1 巨噬细胞特征（前20 个特异性表达的基因）对 ICB 无反应者每个空间簇中的斑点进行评分，并突出了一个具有 SPP1 巨噬细胞和 CAF 共定位的簇（图 4E,G）。空间集群 SPP1 巨噬细胞/CAF的特征得分也高于其他集群（图 4F,H ）。此外，SPPI 巨噬细胞和 CAF 的特征得 分 在 ST 数 据 集 的斑点中（ 图 4L ） 和 三 个 独 立 的 HCC 队 列 的组织转录组数据中显示出明显的正相关。这些结果表明，SPP1 巨噬细胞和 CAFs 可能在 TIB 结构中发生物理作用。此外，研究者发现在 SPP1 巨噬细胞/CAF 集群富集的通路中，有一些基因高度表达，这些基因在细胞外结构组织、细胞外基质（ECM）组织、细胞-细胞、细胞-基质粘附中富集（图 4M）。一致的是，scRNA-seq 数据集中 SPP1巨噬细胞和 CAFs 中特异性表达的基因的功能富集显示了一个共享的KEGG 途径：ECM-受体相互作用；这些结果表明，SPP1 巨噬细胞和 CAFs 的共同定位可能与细胞迁移、粘附和 ECM 组织有关。 此外，研究者用 R 软件包 Niche- Net评估了 SPPI 巨噬细胞和 CAFs 之间的假定串扰，发现 SPPI 巨噬细胞显示出高的 TGFB1、SPP1 和 IL1B配体活性。TGFB1 与 CAFs 上表达的 TGFBR1、TGFBR2 和TGFBR3 结合，而 SPP1 与 CAFs 上的 ITGA4、ITGA9、ITGAV、ITGB1和 ITGB5 相互作用，而 CAFs 上 IL1B 的配体是 IL1R1。因此，胶原蛋白（COL1A1、COL1A2、COL3A1、COL4A1 和 COL5A1）、基质金属蛋白酶（TIMP1 和 MMP）和趋化因子（CCL3、4、5 和 CXCR4）目标基因在这些细胞中表达。这些靶点在脱髓鞘反应中发挥重要作用，包括细胞外壁龛纤维成分和基质金属蛋白酶。值得注意的是，SPP1 巨噬细胞和 CAFs 之间配体-靶点相互作用的靶基因极有可能属于细胞因子-细胞因子受体相互作用、ECM 途径、TNF 信号途径和 IL-17 信号途径（图 4N）。然后，研究者关注前三个配体（TGFB1、SPP1 和 IL1B）和 ECM 相关靶点所诱导的信号通路，发现 HIF1A 和 FOXO1 等调节子，它们在 SPP1 巨噬细胞和 CAFs的肿瘤组织中富集。有助于 ECM 形成的靶基因，如 TIMP1、LUM、FAP 和 PSOTN，也在 CAFs 的肿瘤组织中富集（图 4O）。此外，从 scRNA-seq 数据中得到的 SPP1 成纤维细胞的前 20 个配体和 CAFs 的前 20 个靶体的平均表达量在空间集群 SPP1巨噬细胞/CAFs中高度富集（图 4P-Q ）。这些结果表明，SPP1巨噬细胞和 CAFs 在 TIB 中位置密切，并通过这些配体受体相互作用，促进 TIB 结构的形成。

TIB 结构破坏了恶性细胞和免疫细胞之间的相互作用，限制了对免疫疗法的反应

为了探索 SPP1 巨噬细胞/CAFs 在 TIB 中的潜在作用，研究者评估了 SPP1巨噬细胞/CAFs 和恶性肝细胞与其他空间团块的相互作用权重。研究者发现SPP1巨噬细胞/CAFs集群与ICB无反应者的HCC的相互作用权重最强，但与免疫细胞的相互作用较弱，而 SPP1 巨噬细胞/CAFs、成纤维细胞和免疫细胞与反应者的 HCC 的相互作用权重相当（图 5A，B）。根据对已知免疫特征的分析，在 ICB 无反应者中，CD8 T 淋巴细胞（CD3D 和 CD8A）和细胞毒性标志物（GZMB、GZMK 和 PRF1）对 TIB 结构所包围的肿瘤（图 5C 中的白色虚线内）的浸润有限或没有，而在没有 TIB 结构的 ICB 反应者中则观察到免疫细胞的浸润（图 5D）。 此外，在 SPP1 巨噬细胞/CAFs 中，骨髓细胞的免疫抑制特征和ECM 特征的特征分数相对较高（图 5E 和图 S7G-H），表明 SPP1 巨噬细胞可能与免疫抑制功能有关，CAFs 可能与 ECM 成分的产生有关。为了探索 SPP1 巨噬细胞/CAFs 在 HCC 免疫治疗中的功能作用，研究者计算了 T 细胞炎症基因表达谱（GEP）的特征得分，这是一个与 IFN-y相关的 mRNA 谱生物标志物，用于预测 PD-1 阻断的临床反应，在每个点中的 GEP 基因的平均表达。研究者发现在 TIB 包裹的 HCC 组织中 GEP得分较低，用于评估 GEP 得分的特征在 TIB 包裹的 HCC 组织中没有富集（图 5F，G）。此外，mIHC 染色显示 SPP1 巨噬细胞倾向于定位于肿瘤边界，而 CD8 T 细胞定位于 TIB 外而不是 ICB 无反应者的肿瘤核心（图5H），而反应者的肿瘤中 SPP1 巨噬细胞的浸润较少，CD8 T 细胞的浸润较多（图 5I）。这些结果共同表明，与 SPP1 巨噬细胞相关的 TIB 结构的形成可能有助于 HCC 的免疫抑制性微环境。

靶向 SPP1 破坏 TIB 结构，使 HCC 对免疫治疗敏感

由于 SPP1 是一种分泌型糖磷酸蛋白，其表达与 HCC 的免疫抑制微环境密切相关，因此删除 SPP1 可能会消除 CAF 对免疫微环境的抑制作用，从而使杀伤性 T 细胞浸润到肿瘤核心。为了测试这种可能性，研究者将Spp1f/f 和 Lyz2-Cre 小鼠杂交，产生了一个在单核细胞中选择性缺失 Spp1 的小鼠品系（Spp1f/f; Lyz2-Cre），然后用 Spp1f/f; Lyz2-Cre 和 Spp1f/f 小鼠通过皮下移植 Hepa1-6 细胞，建立一个合成肝肿瘤模型。值得注意的是，与 Spp1f/f小鼠相比，经抗 PD-1治疗的Spp1f/f; Lyz2-Cre 小鼠的肿瘤生长明显减少，治疗效果更好（图 6A）。流式细胞仪分析显示，抗 PD-1 治疗明显增加了 Spplf/f; Lyz2-Cre 小鼠肿瘤区域的肿瘤浸润性 CD8 T 细胞（图 6B）和颗粒酶 B CD8 T 细胞（图 6C）的数量。mIHC 染色结果显示，用 PD-1 治疗的 Spplf/f; Lyz2-Cre 小鼠肿瘤区域 CD8 T 细胞上的颗粒酶 B 染色强度高于其他组（图 6D-E) 此外，研究者检查了抗 SPP1 和抗 PD-1 联合治疗在 Hepa 1-6肝肿瘤模型中的效果。与 SPP1 条件性敲除小鼠的结果类似，在免疫功能正常的小鼠身上，结合抗 SPP1 和抗 PD-1 治疗，诱导肿瘤生长减少，与单独治疗相比，反应率明显提高（图 6F）。抗 SPP1 和抗 PD-1 的联合治疗也明显增加了肿瘤区域的颗粒酶 B 和 CD8 T 细胞的数量（图 6G-H）。重要的是，研究者发现在 SPP1 条件性敲除组或抗 SPP1治疗后，aSMA 成纤维细胞的表达减少。接下来，研究者在同种免疫功能正常的小鼠中生成了 H11LNL- Myc, Alb-Cre 基因小鼠衍生的正位肝癌模型（GDL）。用抗 SPP1 或抗 PD-1 治疗可小幅提高肿瘤GDL 小鼠的总生存率，而抗 SPP1 和抗 PD-1 的联合治疗则使其生存率大幅提高（图 6I）。值得注意的是，抗 SPP1 和抗 PD-1 联合治疗极大地提高了携带肿瘤的 GDL 小鼠的总生存率（图 6I）。此外，抗 SPP1 和抗 PD-1的联合治疗也明显减少了 aSMA 成纤维细胞的比例，并增加了肿瘤区域CD8 T 细胞的比例（图 6J）。此外，研究者用从 Trp53KO/c-MycOE 肿瘤模型获得的肿瘤细胞验证了阻断 SPP1或条件性敲除小鼠体内巨噬细胞特异性缺失的 Spp1，其结果一致。这些结果表明，阻断 SPP1 可以提高抗 PD-1 免疫疗法的疗效。因此，SPP1 可以作为预测需要免疫治疗的 HCC 患者预后的重要生物标志物，而靶向 SPP1 可以在未来进一步使 HCC 对免疫检查点抑制剂敏感。