Epiphany 原发性和复发性人皮肤鳞状细胞癌 - zhengxj1/Papers GitHub Wiki

本研究选取了5例在中南大学湘雅医院病理诊断为cSCC的患者，包括4例原发性cSCC患者和1例复发性cSCC患者。从上述患者中手术切除原发和复发性cSCC的新鲜肿瘤和临近皮肤样本，通过对诊断为原发性或复发性cSCC患者的6个肿瘤组织和3个邻近正常皮肤组织进行scRNA-seq分析，分析TME的情况和发病机制。经过质量控制和几个筛选步骤，保留了14626个高质量细胞进行scRNA-seq分析。

1. cSCC生态系统的单细胞表达图谱

image (B-C) 基于典型细胞标志物的基因表达，检测出7种主要的细胞类型，包括上皮细胞、成纤维细胞、髓系细胞、T细胞、内皮细胞、肥大细胞和B细胞。(D) 对于大多数细胞类型，原发肿瘤含有最高的细胞丰度，复发性cSCCs包含相对较高比例的成纤维细胞和B细胞。相比之下，Bowen病(BW)肿瘤组织的细胞比例最低。(E) 上皮细胞、成纤维细胞和髓细胞是TME的主要成分。

2.复发性cSCC中肿瘤特异性角化细胞的EMT特征

image image A) 4个簇中的细胞均表达已知代表性基因:(1)基础(COL17A1+)，(2)循环(MKI67+， TOP2A+)，(3)分化(KRT1+)， (4) TSK (MMP10+， PTHLH+)细胞。(B) 根据已知标记的表达，将循环细胞分为循环TSKs和基底细胞。(C) ANS和BW的分化细胞比例较高，而原发性和复发性cSCCs的TSKs比例相对较高。(D) 相关分析显示，来自相同样本类型的上皮细胞容易聚集在一起，说明上皮细胞相对于样本部位来源具有高度异质性。(E) RNA速度分析显示，基底细胞和分化细胞倾向于分化为TSKs。(F) 功能富集分析显示，TSK细胞与PI3K-Akt、ecm受体相互作用、局灶粘附和HIF-1信号通路相关，被证明与肿瘤进展或对癌症治疗的耐药性有关。(G-H) 在原发性和复发性cSCC的TSK细胞中鉴定了差异表达基因，发现两个emt相关基因VIM和TGFB1在复发性cSCC中表达上调。(I) 计算了tsk的EMT特征评分，发现复发性cSCC的EMT评分明显更高。(J-M) 免疫组化染色验证VIM和TGFB1在cSCC中的表达，结果显示，VIM和TGFB1在复发性cSCC中均显著高表达，提示cSCC的复发与EMT相关。

3.复发性cSCC中的T细胞排斥微环境

image T细胞的亚聚类鉴定出五个亚群:(1)效应CD4+ T细胞(CD4+， CCR7-)， (2) treg细胞(CD4+， IL2RA+， FOXP3+， CTLA4+)，(3)幼稚CD4+ T细胞(CD4+， CCR7+， SELL+)，(4)效应CD8+ T细胞(CD8+， GZMA+)，和(5)CD8+细胞毒性细胞(CD8+， IFNG+， GZMA+)。(C) 上述不同群体的T细胞根据基因表达水平进一步聚类。结果显示，来自ANS和原发cSCC的T细胞倾向于聚集在一起，来自复发性cSCC的T细胞相对于其他起源位点具有明显的模式。(D) 接下来评估了效应CD8+ T细胞和CD8+细胞毒性T细胞的衰竭评分，并在ANS、原发性和复发性cSCCs之间进行了比较。与ANS相比，效应CD8+ T细胞和CD8+细胞毒性T细胞在原发性cSCC中显示出更高的衰竭评分。相比之下，与ANS和原发性cSCC相比，CD8+细胞毒性T细胞在复发性cSCC中有更高的衰竭评分。(E) 在原发cSCC中，CTLA4和T细胞免疫受体(TIGIT)在效应CD8+ T细胞中高表达，TIGIT在CD8+细胞毒性T细胞中高表达。在复发性cSCC中，效应CD8+ T细胞表现出高水平的HAVCR2 (TIM3)和CXCL13，而CD8+细胞毒T细胞表现出高水平的CTLA4和CXCL13以及相对较高水平的LAG3。(F) 评估了炎症评分，以更深入地了解ANS和原发性和复发性cSCCs之间的炎症变化，重点关注4种途径。对于效应CD8+ T细胞，原发性cSCC表现出与ANS相似的活性评分，而复发性cSCC在肿瘤坏死因子(TNF)和IL-17信号通路中的炎症评分显著降低。对于CD8+细胞毒性T细胞，除了IL-17信号通路外，原发性cSCC的炎症评分与ANS相似，而TNF和nod样受体信号通路的活性评分在复发性cSCC中明显降低。(G) 与原发性cSCC相比，GSEA显示复发性cSCC中CD8+细胞毒性T细胞的“氧化磷酸化”过程上调，说明细胞处于代谢活跃状态。复发性cSCC表现出低浸润和T细胞炎症评分降低，这可能是cSCC复发的关键原因。

4. 复发性cSCC中 SPP1+ CD209high/low TAMs的原始表型

image (A) 2,693个髓系细胞被聚成10个亚群。共有4个群体被指定为TAMs，特征不同:(1)SPP1+ CD209high TAMs (SPP1+、CD209high、CD163+、MRC1+、CCL18+)， (2) SPP1+ CD209low TAMs (SPP1+、CD209low、CD163+、MRC1+、CCL18+)， (3) CXCL10+ TAMs (CD163+、MRC1+、CXCL10+)，(4)循环TAMs (CD209+、CD163+、MRC1+、TOP2A+、MKI67+)。此外，一个簇被鉴定为单核细胞(VEGFA+、VCAN+、FCN1+)， 3个亚群被鉴定为dc:(1) CD14+ dc (CD1A-、CD14+、CD1C+)， (2) CLEC9A+ dc (CLEC9A+、CD1C+)， (3) CD1A+ CD1C+ dc (CLEC10A+、CD1A+、CD1C+、CD14-)。将MDSCs分为2个亚组:(1)CXCL9-11+ MDSCs (CXCL9+， CXCL10+， CXCL11+， IL1B+， S100A8+， S100A9+)和(2)CXCL1-3+ MDSCs (CXCL1+， CXCL2+， CXCL3+， IL1B+， S100A8+， S100A9+)。(B) 各亚群marker。(C) RNA速度分析显示从TAMs和DCs向单核细胞的转变方向，MDSCs位于分化轨迹的末端。(D-E) 检测了TAMs的血管生成和吞噬特性，发现这些亚群具有不同的特征。SPP1+ CD209high TAMs的吞噬评分高于SPP1+ CD209low TAMs，而SPP1+ CD209low TAMs的血管生成评分最高。(F) CD1a+ CD1c+ DCs的吞噬评分最高。与原发性cSCC相比，复发性cSCC中SPP1+ cd209高TAMs、CD1a+ CD1c+ DCs和循环TAMs的吞噬评分降低。(G) SPP1+ cd209高的TAMs在原发性和复发性cSCCs中显示血管生成评分显著增加。

5.复发性cscc富集的IL7R+ CAFs与肿瘤特异性角质形成细胞之间的相互作用

image (A-B) 2828个成纤维细胞根据标记基因的表达分为3个亚群，包括(1)mCAFs (RGS5+， DCN+， COL6A2+， COL1A1+， COL1A2+)， (2) iCAFs (RGS5-， DCN+， COL6A2+， COL6A2+， COL1A1+， COL1A2+)， (3) IL7R+ CAFs (IL7R+， IL1B+， IL6+， CXCL1+， CXCL3+， CXCL5+， CXCL6+， CXCL8+， CXCL13+， CXCL14+， DCN+， COL6A2+， COL1A1+， COL1A2+)。(C) 值得注意的是，IL7R+ CAFs在复发性cSCC中更为丰富，而原发性cSCC中mCAFs的比例相对较高。(D) RNA速度分析揭示了iCAFs向mCAFs和iCAFs向IL7R+ CAFs的转变方向，说明iCAFs可以分化为mCAFs和IL7R+ CAFs，这可能分别与原发性cSCC和复发性cSCC有关。(E) 计算IL7R+ CAFs的炎症评分，在ANS、原发性和复发性cSCCs之间进行比较。在所有四种被研究的途径中，原发性cSCC的炎症评分均略有增加，复发性cSCC的炎症评分显著降低，表明IL7R+ CAFs在cSCC复发过程中具有较低的炎症特征。(F-G) 使用CellChat进行细胞间通讯分析，以更深入地了解IL7R+ CAFs的生物学功能。有趣的是，IL7R+ CAFs表达了大量与EMT相关的配体，如胶原蛋白[由COL1A1、COL1A2、COL4A1、COL6A1、COL6A2、COL6A3编码]、纤连蛋白1[由FN1编码]、肌球蛋白C[由TNC编码]和THY1[由THY1编码]。这些配体的受体在广泛的细胞中表达，随后诱导典型的细胞-细胞相互作用。值得注意的是，在胶原蛋白、FN1和TEAD信号通路中，IL7R+ CAFs与TSKs的相互作用最强。

6.细胞-细胞相互作用分析mdk依赖通路在复发性cSCC中的作用

image (A) iCAFs和IL7R+ CAFs在原发性cSCC中与其他细胞的相互作用更多。相比之下，在复发性cSCC中，TSKs、iCAFs、mCAFs和IL7R+ CAFs是与其他细胞交流的主要细胞。(B) MDK是一种肝素结合生长因子，据报道在几种人类癌症中作为一种重要的调节因子，支持细胞转化、生长、存活、迁移和血管生成。有趣的是，原发性和复发性cSCCs具有明显的mdk相关相互作用关系。在原发性cSCC中，iCAFs和IL7R+ CAFs产生高水平的MDK来介导细胞间通讯，而在复发性cSCC中，TSKs分泌高水平的MDK，其受体表达在TSKs和其他细胞上，从而调节TSKs内强烈的细胞-细胞相互作用。(C-D) 通过研究正常皮肤和光化性角化病(AK)样本中MDK和VIM(成纤维细胞的一般标记物)的表达来检测MDK对成纤维细胞的影响。与正常皮肤相比，AK患者皮下的VIM上调，表明皮下成纤维细胞增多。(E-F) MDK也参与了cSCC的复发，第一次和第二次复发的肿瘤组织中MDK的表达水平高于原发性cSCC。(G) cSCC肿瘤样本MDK与VIM评分、MDK与TGFB1的散点图。