Result 1 CAF抑制HCC细胞对索拉非尼和仑伐替尼的敏感性

CAF、癌旁成纤维细胞和NFs表现出纺锤形形态。相对于癌旁成纤维细胞和NFs，α-SMA在CAF中过表达（图1A）。评估CAFs对索拉非尼和仑伐替尼敏感性的HCC的旁分泌效应。在细胞活力、细胞增殖和半胱天冬酶 3/7 活性测定中，与 CAF-CM 一起孵育的 HCC 细胞中的 TKI 反应明显低于与癌旁成纤维细胞 CM 或 NF-CM 孵育的 HCC 细胞（图 1B-D）。接下来，蛋白质印迹和相应的密度分析显示CAF-CM对HCC细胞对TKI诱导的细胞凋亡具有保护作用。这些结果表明，CAF以旁分泌方式诱导TKI耐药性。此外，在体内1测定中，CAF + Sor组表现出明显高于Sor组的肿瘤体积（图 1E）。

Result 2 鉴定出在CAF中特异性过表达的基因

在聚类分析中，与癌旁成纤维细胞和NF相比，CAF中有790个基因显着过表达（图2A）。GSEA表明，CAF中特异性过表达的基因在各种癌症相关途径中富集，包括EMT和Kirsten大鼠肉瘤病毒（KRAS）信号通路（图2B）。 在CAFs中过表达的790个基因中，选择了245个在CAFs中相对于癌旁成纤维细胞或NFs过表达大于1.5倍变化（P < 0.001）的基因进行下一步的研究（图2C）。然后，鉴于CAF主要以旁分泌方式诱导TKI耐药，我们在245个基因中只选择了分泌蛋白编码基因进行进一步分析（图1）。因此，我们选择了9个分泌蛋白编码基因作为进一步调查的候选分子（图2C）。 在GSE9数据集的HCC组织表达数据中评估了109211个候选基因的表达水平（图 2D）。GSE109211包括HCC组织的基因表达数据和索拉非尼反应的临床信息。在9个候选基因中，与应答者相比，SPP1在索拉非尼无应答者中被确定为显着过度表达（图2E）。

Result 3 CAF是HCC TME中分泌性SPP1的主要来源

为了确定HCC TME中分泌性SPP1的主要来源，通过蛋白质印迹和相对密度条形图评估了两种HCC细胞系的细胞裂解物和CM，CAF，癌旁成纤维细胞和NF中的SPP1水平。与其他细胞系相比，CAF-CM和CAF细胞裂解物中的SPP1表达最高。

接下来，我们使用IF染色验证了SPP1和α-SMA在石蜡包埋的HCC组织中的共定位（图2F）。正如预期的那样，HCC肿瘤基质中的CAF表现出强烈的α-SMA表达，表明CAF是HCC基质的主要成分。在肿瘤基质中观察到α-SMA阳性CAFs，不仅位于肿瘤外围，而且位于肿瘤体积的中心。观察到SPP1在α-SMA阳性CAF中的共表达。

图2G显示了来自1对CAF和癌旁成纤维细胞的WTS数据中CAF和癌旁成纤维细胞之间SPP9表达的比较。我们将5名相对于配对的癌旁成纤维细胞在CAF中具有SPP1过表达的患者分为SPP1高组，并将其他患者分为SPP1低组。在IHC分析中，与非肿瘤纤维组织、肿瘤核心和肿瘤外围相比，SPP1高组在肿瘤基质中表现出强烈的SPP1阳性染色。在SPP1高组和SPP1低组SPP1表达比较中，SPP1高组肿瘤基质中的SPP1表达明显高于SPP1低组（图2H-I），与RNA表达数据一致;正如预期的那样，两组之间非肿瘤纤维组织、肿瘤核心和肿瘤周边的比较没有显着差异。综上所述，这些结果证实了CAF是HCC TME中分泌性SPP1的主要来源。

Result 4 阻断CAF衍生的SPP1恢复了HCC细胞对索拉非尼或仑伐替尼的敏感性

进行伤口愈合、迁移和跨孔侵袭测定以评估细胞的迁移和侵袭潜力。索拉非尼或仑伐替尼治疗显着降低了Huh-7细胞伤口愈合，迁移和侵袭的能力（图3A-C）。有趣的是，SPP1-BP治疗恢复了CAF-CM-或rSPP1治疗的HCC的敏感性降低，导致伤口愈合，迁移和侵袭能力显著降低（图3D-F）。

Result 5 体内验证阻断CAF衍生的SPP1对HCC对TKI耐药性的影响

在利用Huh-7细胞建立的皮下异种移植HCC模型中，CAF组的平均肿瘤体积和重量最高;CAF + Sor 组表现出明显大于 Sor 组的肿瘤和更重;与CAF + Sor组相比，CAF + Sor + SPP1-APT组的肿瘤体积和重量显着减少（图4A-C）。这些结果表明，抑制SPP1可以恢复CAF诱导的索拉非尼耐药性。然后，我们对分离的肿瘤组织进行了IHC分析，并通过量化肿瘤切片中的染色区域来观察到差异（图4D-E）。CAF + Sor + SPP1-APT组的α-SMA、纤连蛋白、SPP67和Ki1表达水平显著降低，E-钙粘蛋白表达水平高于CAF组和CAF + Sor组。这表明索拉非尼和SPP1-APT联合疗法通过在体内抑制CAF衍生的SPP1，有效地抑制了肿瘤细胞的增殖和EMT。使用原位异种移植HCC模型进一步证实了这一点，该模型更准确地代表了HCC TME。图4F显示了细胞注射后第0天，第12天和第21天的代表性肝脏和原位肿瘤图像。原位异种移植模型的结果与皮下异种移植模型的结果非常相似。与其他组相比，CAF + Sor + SPP1-APT组表现出最小的肿瘤体积（图4G）。在肿瘤重量的比较中，与CAF组相比，CAF + Sor + SPP1-APT组的肿瘤重量显着降低（图4H）。此外，我们比较了两组之间的肝内转移灶数量（图4I）。与其他组相比，CAF组表现出显着更多的肝内转移灶数量。CAF + Sor + SPP1-APT组和Sor组未观察到肝内转移。

Result 6 CAF衍生的SPP1与HCC细胞表面的整合素复合物结合

我们探索了HCC细胞中的SPP1受体结合蛋白（RBP）。如先前的研究报道，蛋白质-蛋白质网络分析显示CD44和各种整合素是重要的SPP1 RBP。在候选RBP中，ITGA5，ITGAV，ITGB1和ITGB5在Hep3B和Huh-7细胞中表达，而其他整合素和CD44则不表达（图5A）。我们随后使用荧光强度确认了Hep44B和Huh-3细胞中CD7和整合素的相似表达模式（图5B）。共IP实验证实了SPP1与HCC细胞中的ITGA5，ITGAV，ITGB1和ITGB5的结合（图5C）。Hep3B和Huh-7细胞分别用siITGB1和/或siITGB5转染以沉默ITGB1和ITGB5。在共IP实验中，在CAF-CM处理后的ITGB1沉默的HCC细胞中证实了SPP5与ITGAV和ITGB1的结合;SPP1 还与 ITGB1 沉默的 HCC 细胞中的 ITGB5、ITGB5 和 ITGAV 结合;在缺乏ITGB1和ITGB5的HCC细胞中，未检测到SPP1与整合素的结合（图5D）。用SPP1-BP处理破坏了SPP1与HCC细胞整合素的结合（图5E）。我们的结果证实，CAF衍生的SPP1与HCC细胞上的整合素αVβ5，α5β1和αVβ1结合。

Result 7 CAF衍生的SPP1通过HCC细胞中的PKCα磷酸化激活了RAF/ERK/STAT3和PI3K/AKT/mTOR信号通路

既往研究表明，TKI（包括索拉非尼和仑伐替尼）通过靶向RTK抑制RAF/MAPK/STAT3和PI3K/AKT/mTOR信号通路，从而抑制肿瘤进展。细胞景观分析表明，SPP1信号通路由SPP1-整合素相互作用启动，随后通过PKCα的激活激活MAPK和AKT通路。因此，我们假设CAF衍生的SPP1通过整合素介导的PKCα磷酸化通过旁路激活RAF / ERK / STAT3和PI3K / AKT / mTOR途径来诱导对TKI的抗性。用CAF-CM处理的HCC细胞中PKCα，BRAF / ERK / STAT3和PI3K / AKT / mTOR的磷酸化显着上调（图6A-B）。当HCC细胞与CAF-CM或rSPP1孵育时，PKCα/BRAF/ERK/STAT3和PI3K/AKT/mTOR的磷酸化受到索拉非尼或仑伐替尼治疗的轻微影响。然而，当用SPP1-BP处理细胞时，即使在与CAF-CM或rSPP3孵育的情况下，TKI也显着抑制了PKCα，BRAF / ERK / STAT3和PI1K / AKT / mTOR的磷酸化（图6A-B）。我们还评估了在ITGB3和/或ITGB3沉默下TKI诱导的PKCα，BRAF / ERK / STAT1和PI5K / AKT / mTOR磷酸化的变化。当用siITGB1和/或siITGB5转染HCC细胞时，即使在与CAF-CM孵育后，TCI处理也显着降低了HCC细胞中PI3K / AKT / mTOR和BRAF / ERK / STAT3的磷酸化（图6C-D）。总体而言，这些发现表明，CAF衍生的SPP1通过整合素介导的PKCα磷酸化诱导TKI抵抗RAF / ERK / STAT3和PI3K / AKT / mTOR信号通路的旁路激活。

Result 8 SPP1相关基因标记提示肝细胞癌患者预后不良

我们使用TCGA LIHC的数据检查了HCC组织中SPP1表达的临床相关性。在TCGA LIHC数据集中，与非肿瘤组织相比，HCC组织中的SPP1显着上调，并且发现SPP1表达随着组织学分级和肝病临床状态的提高而逐渐增加（图7A）。SPP1表达高的患者表现出短OS和DFS（图 7B）。我们随后评估了SPP1相关的基因特征。与SPP1高度相关的基因集被选为SPP1相关基因标记。在TCGA LIHC数据集中，HCC患者可以根据SPP1相关基因集的表达模式分为两个簇（图7C）。与低表达相比，SPP1相关基因高表达的簇的OS和DFS显著短（图 7C）。这些结果表明，SPP1相关基因标记的表达与肝癌患者的预后显著相关。

SPP1相关基因特征在多种癌症相关途径中富集（图7D）。其中，EMT相关基因集的富集最为丰富。从EMT基因集中随机选择的1个EMT相关基因（ITGAV、NTM、COMP和FAP）的表达水平与TCGA LIHC中的SPP11表达具有高度相关性。在蛋白质印迹和相对密度条形图上，Vimentin和Snail在索拉非尼或仑伐替尼治疗后下调，同时显着增加E-钙粘蛋白表达。然而，用CAF-CM或rSPP1处理的HCC细胞中EMT相关蛋白的表达不受TKI处理的影响。此外，SPP1-BP处理完全逆转了CAF-CM和rSPP对EMT相关蛋白表达的影响。

为了评估不同成纤维细胞亚群中SPP1表达的差异，我们处理并分析了来自HCC患者的公开单细胞RNA-seq数据集（GSE151530）。我们从56，721个QC过滤细胞中鉴定了七种细胞类型（图7E），其中成纤维细胞进一步聚集成六个细胞簇，表示为C0至C5（图7F-G）。值得注意的是，SPP1主要在C4细胞中表达（图7H）。因此，我们使用“MSigDB Hallmark”数据库来鉴定C4成纤维细胞的分子特征;EMT似乎是最丰富的术语（图7I）。

Result 9 索拉非尼或仑伐替尼治疗前血浆SPP1水平是晚期肝癌患者PFS或OS的独立预测指标

随后，我们研究了索拉非尼或仑伐替尼治疗开始前的血浆SPP1水平是否是预测晚期肝癌患者PFS或OS的有用预后生物标志物。在54例患者中，36例接受索拉非尼治疗，18例接受仑伐替尼治疗。25例患者对治疗有部分反应（PR），23例病情稳定（SD），8例表现为进展性疾病（PD;图8A）。图11B显示了达到TKIPR的患者的代表性CT扫描。补充图S1H显示，PD患者的血浆SPP<>水平明显高于PR或SD患者。

在纳入的患者中，那些血浆SPP1水平高的患者（> 2,300 pg/mL，n = 28）与血浆SPP1水平低的患者（≤ 2,300 pg/mL，n = 26）相比，其PFS和OS明显缩短（PFS，对数rank P < 0. 001，图8C，左；OS，对数rank P = 0.002；图8D，左）。在接受索拉非尼治疗的组中（n = 36），血浆SPP1水平高的患者表现出较短的PFS和OS（PFS，对数rank P = 0. 005，图8C，中间；OS，对数rank P = 0.007，图8D，中间）。此外，在仑伐替尼组（n = 18）中，血浆SPP1水平高的患者的PFS（log-rank P = 0.011，图8C，右）和OS（Breslow P = 0.037，图8D，右）显著缩短。