空间分辨的多组学单细胞分析为胰腺癌的免疫功能障碍机制提供信息 - zhengxj1/Papers GitHub Wiki

文章标题：空间分辨的多组学单细胞分析为胰腺癌的免疫功能障碍机制提供信息

英文标题：Spatially resolved multi-omics single-cell analyses inform mechanisms of immune-dysfunction in pancreatic cancer

来源期刊：Gastroenterology

影响因子：33.883

人类 PDAC 的免疫微环境的单细胞图谱

研究人员首先对胰腺癌新鲜肿瘤和邻近非肿瘤胰腺组织进行了 scRNAseq。然后应用流式细胞仪（FACS）从组织样本单细胞悬液中分选足够数量的 CD45+ 细胞，使用 10x Genomics Chromium 平台对分类的 EpCAM-CD45+细胞群进行 scRNAseq。在 3 名患者中，他们还对部分 CD45- 细胞进行了测序。使用多重荧光免疫组织化学（mfIHC）和空间转录组学对未受干扰的肿瘤微环境（TME）中的原位免疫反应进行匹配分析。同时用质谱流式（CyTOF）和 FACS 分析了从肿瘤切片中获得的白细胞组分和从术前收集的每个病人的血样中获得的人外周血单核细胞（PBMC）。

为了确定免疫表型与患者预后的关联，研究人员用 mfIHC 评估了 30 名患者手术切除标本中的免疫细胞亚型，并将结果与 TCGA 和 ICGC 数据库中的治疗无效的 PDAC 患者群进行了验证。鉴于免疫检查点阻断在其他胃肠道癌症和肺癌中的成功，而在 PDAC 中大多无效，研究者拟探索 PDAC 免疫微环境的具体区分特征。为此，他们收集了已发布的结直肠癌（CRC）、胃癌（GC）和肺腺癌（LUAD）scRNAseq 数据集的原始数据矩阵，并使用一个共同的分析方式比较免疫细胞的比例和表型。

PDAC 的肿瘤微环境中 CD8 T 细胞功能失调

研究者对 CD8 T 细胞进行子聚类，确定了 6 个定义明确的细胞亚群，它们在肿瘤和邻近的非肿瘤样本中共享（图 2A，B）。除了幼稚 CD8 T 细胞和衰竭 CD8 T（CD8 Tex）细胞外，还发现了一个 CD8 组织常驻记忆（CD8 Trm）表型的细胞群，以及三个 CD8 T 效应（CD8 Teff）细胞群，根据它们对 GZMK、GNLY 和 IFNG 的不同表达，将其命名为 CD8 Teff-GZMK、CD8 Teff-GNLY 和 CD8 Teff-IFNG（图 2B）。

CD8 Teff 细胞群的差异基因表达分析显示，CD8 Teff-GNLY 细胞在各 Teff 细胞群中表达的细胞毒性模块，在肿瘤浸润的 CD8 Teff 细胞群中被明显下调（图 2C），结果表明尽管 CD8 Teff 细胞存在于 PDAC TME 中，但它们的细胞毒性潜力可能受到损害。

为了更好地了解 PDAC TME 内 CD8 T 细胞群的演变，研究者进行了轨迹分析。结果显示，幼稚的 CD8 T 细胞位于轨迹路径的起点，而 CD8 Tex、CD8 Teff-IFNG 和 CD8 Teff-GZMK 细胞大多位于终点状态（图 2D）。这表明 PDAC 中的 CD8 T 细胞逐渐获得衰竭和功能失调的表型。

随后，通过 mfIHC 分析验证了 PDAC TME 内表达各种抑制性受体的衰竭的 CD8 T 细胞的存在（图 2E）。进一步分析了 CD8 T 细胞的空间分布，特别是以穿孔蛋白 perforin（PRF1）表达为标志的细胞毒性亚群。

值得注意的是，PRF1+CD8+T 细胞几乎不存在于 PDAC TME 内，而倾向于在肿瘤边界和 CD163+巨噬细胞附近稍微富集（图 2F-I）。虽然 Teff 和 Tem 亚群占外周血中 CD8 T 细胞的大部分，但它们在 TME 中只占不到 30%。令人惊讶的是，CD8 Tcm 细胞不仅在肿瘤内几乎不存在，而且在全身也不存在，这同样被 FACS 证实。接下来，研究者们比较了 PDAC 和 LUAD 中肿瘤浸润性 CD8 T 细胞的频率和转录状态。在 LUAD 中没有检测到 CD8 Trm 细胞（图 2J），而 CD8 Teff 细胞表达更高水平的 PRF1 和 GZMB，表明 LUAD 中 CD8 Teff 群体具有更高的细胞毒性潜力，以及更高水平的 PDCD1 和 CTLA4（图 2K）。以上研究结果表明，CD8 T 细胞的功能在 PDAC TME 中失调。

NKT 细胞的功能在 PDAC 的肿瘤微环境中失调

基于 scRNAseq 数据进一步分析了发现的 NKT 细胞。研究人员首先通过 mfIHC 证实在两个部位都存在 CD3+CD56+ 细胞（图 3A）。与 CD8 Teff 细胞相似，NKT 细胞具有较高的细胞毒性潜力，其标志是在邻近的非肿瘤组织中 GZMB、GNLY 和 PRF1 的表达较高，而在肿瘤部位，这些细胞的特点是免疫抑制分子的表达升高（图 3B）。

耐人寻味的是，IRF8，一种已知对 NK 细胞功能成熟至关重要的转录因子，在非肿瘤区域的 NKT 细胞中表达水平也明显较高（图 3C），表明在 TME 中 NKT 细胞在功能上仍未成熟。为了确定 NKT 细胞的功能障碍是否也存在于系统循环中，研究人员用 FACS 分析了外周血和肿瘤样本中的 NKT 细胞（图 3D）。外周血中的 NKT 细胞显示出更强的细胞毒性表型，具有更高的穿孔蛋白表达和更高的细胞毒性活性，这在肿瘤浸润的 NKT 细胞中几乎完全减弱（图 3E）。

此外，肿瘤浸润的 NKT 细胞表现出一种异常耗竭的表型，共同表达 TIM3、LAG3 和 CTLA4（图 3F），并以表达 CD4、IL-4 和 IL-13 的主要调节表型为标志（图 3 G）。

NKT 细胞倾向于在肿瘤边界富集（图 3 H，I），通过配体-受体分析推断出导管/肿瘤细胞和 NKT 细胞之间的许多免疫调节作用，概率值很高，包括 MIF-CD74，以前已被证明能促进肿瘤免疫逃避。此外，NKG2A 和非经典 MHC-I 分子 HLA-E 的相互作用，已被证明会损害 NKT 细胞的细胞毒性活性并限制抗肿瘤免疫反应，在不同的细胞类型中突出显示出来（图 3J）。有趣的是，与 CRC、GC 和 LUAD 的 NKT 细胞相比，PDAC 的效应分子的表达影响更为显著（图 3K）。