bulkRNA-seq分析与实践路线

更新：2026-10-15；状态：可用；验证范围：原生R与公开airway计数案例已执行；范围和结果见正文。

从样本设计和计数来源出发，完成基因层面差异分析，再进入解释与验证。

先选起点

已有计数矩阵，先读RNA计数矩阵与样本表核对；已有FASTQ，先读RNA-seq从FASTQ到基因计数。两条路径在“有来源、有单位、样本对应正确的计数”汇合。TPM、标准化计数和原始计数不能因为都是数字表就互换。

建议阅读顺序

1. RNA设计矩阵配对与对比方向：研究单位、配对因素、参考水平和可估计性。
2. RNA文库大小因子与组成偏差、负二项离散度与均值方差：为什么不能逐基因照搬普通t检验。
3. DESeq2安装对象与结果提取，然后实际运行公开airway数据贯通DESeq2。
4. 独立过滤低计数与结果NA、VSTrlog与样本距离、RNA效应收缩与阈值检验：读懂诊断和结果。
5. RNA差异结果报告与富集背景与转录组差异与qPCR验证设计：组织证据和后续验证。

本轮完成和未完成

原生R实际运行公开airway的8个样本计数，完成配对DESeq2、apeglm收缩、效应阈值检验、VST/PCA及输入错误检查。FASTQ比对、featureCounts、Salmon/tximport、复杂交互与LRT在本轮仍为指南，没有执行。

单细胞数据先看单细胞差异表达与差异丰度；细胞数不能自动替代供体重复。bulkRNA-seq也不直接回答剪接、转录本使用或单细胞组成变化等全部问题。