RNA-seq从计数矩阵到差异表达

更新：2026-10-15；状态：可用；验证范围：公开airway计数流程已在原生R4.4.3/DESeq2 1.46.0执行；FASTQ上游未测。

从基因计数和实验设计出发，估计表达差异，并区分统计证据、效应大小与功能解释。

两个起点

已有 FASTQ 时，先完成原始质量评估、比对或定量、基因层面汇总和样本检查；可参考 nf-core/rnaseq。已有计数矩阵时，先确认行是基因、列是样本、计数单位及前序处理，见计数丰度与标准化。

可复现的官方数据练习

需要原生R及Bioconductor的airway与DESeq2。先按R包Python包与可复现环境在R控制台安装这两个包，再执行下面代码；安装与载入不同。2026-10-15已在原生R实际运行airway计数模型；完整环境、命令、输出和诊断见公开airway数据贯通DESeq2。下方片段是模型核心，完整脚本还核对样本、对比、收缩及NA。

library(airway)
library(DESeq2)
data(airway)
airway$dex <- relevel(airway$dex, ref = "untrt")
dds <- DESeqDataSet(airway, design = ~ cell + dex)
dds <- dds[rowSums(counts(dds)) >= 10, ]
dds <- DESeq(dds)
res <- results(dds, contrast = c("dex", "trt", "untrt"), alpha = 0.05)
write.csv(as.data.frame(res), "airway_differential_expression.csv")
sessionInfo()

cell 表示该数据中的细胞系配对因素，dex 是处理条件；它们的含义不能直接复制到自己的样本。低计数筛选是练习选择。对比方向为 trt 相对 untrt，正 log2FoldChange 表示该方向上的增加。

检查与解释

先检查样本对应、设计矩阵可估计性、样本距离和离群；保留原始计数。结果表同时读 baseMean、log2FoldChange、lfcSE、P 和 padj，排查 NA 原因。展示使用的变换值与检验输入分开保存。

通路解释见富集分析与GSEA。批次和重复问题见批次效应与混杂、生物学重复与技术重复。

深入：DESeq2 官方教程、airway 数据包、DESeq2 原始论文。

统计基础与验证入口

转录组差异与qPCR验证设计补充本任务所需的统计或验证判断。分析前先确认统计方法选择与分析计划，结果解释时区分组学验证的层级与证据。

测序技术与上游输入

先确认RNA测序建库选择与偏倚与链特异性与RNA测序方向，再生成计数；RNA来源、UMI和read布局影响有效计数。

对应方法与深入

RNA计数模型差异表达与效应收缩、组学批次校正与信号保留解释输入条件和适用边界；软件运行步骤与方法假设一起核对。

拆分阅读入口

bulkRNA-seq分析与实践路线给出顺序。输入先看RNA计数矩阵与样本表核对，模型先看RNA设计矩阵配对与对比方向；结果NA、VST和收缩分别见独立过滤低计数与结果NA、VSTrlog与样本距离、RNA效应收缩与阈值检验。真实FASTQ到计数目前仍为RNA-seq从FASTQ到基因计数指南。