RNA文库大小因子与组成偏差

更新：2026-10-15；状态：可用；验证范围：原生R与公开airway计数案例已执行；范围和结果见正文。

归一化需要处理文库尺度与组成差异，但不能从相对计数自动恢复绝对RNA总量。

为什么总计数比例可能失效

假设样本B有一个极高表达基因占去大量reads，即使其他基因的绝对分子量没变，观察到的相对份额也可能下降。把每列总计数统一到相同值，可能把组成变化传播到其他基因。

DESeq2常用median-of-ratios估计样本尺度：在可用基因上形成相对于跨样本几何均值的比值，再取样本中位数。大量基因共享同方向变化、零值和特殊实验设计都需评估；它不是任何数据都正确的自动校准器。DESeq2原始研究说明模型与归一化。

标准化不等于批次校正

counts(dds, normalized=TRUE)主要反映模型使用的归一化因子，不能因设计含cell或batch就声称该表已移除了这些因素。VST同样不会自动消除批次。

检验仍使用计数及模型中的尺度，不把归一化表再次作为原始计数输入。若研究绝对表达的整体变化，需要相应实验校准和假设，不能只从常规相对RNA-seq结果推断。

见计数丰度与标准化、VSTrlog与样本距离；本例实际大小因子和文库计数在sample-qc.csv。