微生物组差异与验证设计

更新：2026-10-13；状态：可用；验证范围：原始研究与官方规范核对；实验设计说明，未执行湿实验或真实组学验证。

把微生物特征差异、多样性、测量污染和独立重复分别验证。

先确认样本与分母

输入通常是样本×ASV/物种/功能特征的计数或相对丰度，独立单位来自供体、地点或其他设计。测序读段数不等于绝对微生物量，相对丰度增加也可能来自其他成分减少。

检查空白、污染、批次、抽样时间和重复采样，分类注释需记录数据库与版本。16S的某个ASV不能自动确认唯一菌株或其功能。

多样性检验在问什么

alpha多样性是在样本内定义的指标，比较时需考虑指标、测序覆盖及协变量。beta多样性基于样本间距离，PERMANOVA检验相应距离结构的组别效应，并依赖合适的置换设计。

组内离散度差异也可能影响PERMANOVA解释，应检查PERMDISP等相关诊断及图形。重复采样或匹配设计不能随意全局交换组标签。距离选择、稀释和变换应说明，不把一个流程默认值视为唯一选择。

差异丰度与功能验证

大量特征需要多重校正，组成约束、零值和采样量需要适当模型。不能在每个相对丰度列做普通独立t检验后忽略所有依赖与分母问题。ANCOM-BC等方法有各自假设与输入要求，应按官方教程理解。

独立样本、适当的靶向定量或其他测量可进一步确认特征；基于分类组成推断的功能，与直接测量功能或代谢物不同。观察到共现也不直接证明物种之间相互作用。

保存的证据

记录抽样单位、原始计数、注释版本、污染检查、距离与模型、置换限制、候选规则和独立验证。基本流程见微生物组分析入门与实践及ASV与微生物多样性。

接口参考：QIIME 2 2024.10归档版组间距离检验、ANCOM-BC2官方教程。前者是归档版说明，安装时另核对当前版本。