单细胞差异表达与差异丰度

更新：2026-10-26；状态：可用；验证范围：2026-10-26官方/原始来源核对；标准库教学演示实际执行；专业验证范围见正文。

把目标和独立单位放在第一行

差异表达/状态问同一细胞类型内部的表达是否随条件改变；差异丰度问采集到的类型或邻域组成是否改变。细胞多不等于供体多。学完应能画出供体→细胞类型→细胞层级，并知道何时不能填零。前置读生物学重复与技术重复、单细胞降维邻居图与聚类原理和RNA计数模型差异表达与效应收缩。

为什么不能把几千个细胞当几千名受试者

一个供体的细胞共享遗传、处理、采样与技术环境。若条件施加在供体层面，直接把细胞当全部独立重复会低估相应不确定性。Squair等原始研究系统讨论了忽略生物学重复的假发现问题。处理应匹配实验单位，不是用一个更严格P阈值代替正确层级。

概念上可写 $Y_{gdc}=\mu_g+\beta_gT_d+u_{gd}+\epsilon_{gdc}$，$g$是基因、$d$是供体、$c$是其细胞，$T_d$为条件，$u_{gd}$是共享供体影响。它是解释相关性的线性示意，真实原始计数可能需负二项、文库尺度和其他层级；不能直接用该式对所有零计数套普通正态检验。

一个权重不同就改结论的例子

A组供体A1有100细胞，平均值1；A2有10细胞，平均值9。B组B1有100细胞，均值4；B2有10细胞，均值6。若把细胞全混在一起，A均值190/110≈1.727，B均值460/110≈4.182，看起来差很多。按供体等权，A=(1+9)/2=5，B=(4+6)/2=5。

这不表示“供体均值t检验永远正确”，而是说明观测权重和推断单位改变目标。也不是真实pseudobulk归一化：toy用连续均值，不包含基因文库尺度、原始计数和供体差异模型。

pseudobulk的实际步骤

在适用设计下，对每个供体×细胞类型把原始计数按基因求和：$K_{gd,t}=\sum_{c\in(d,t)}K_{gdc}$。$t$是细胞类型；这样每列仍对应供体的一个类型样本，再用匹配设计的计数模型、归一化与过滤。不能先把log表达平均再冒充原始整数计数，也不应跨条件合并供体后只剩两列。

若某供体未采到这一类型，不等于测到该类型所有基因表达为0。应区分类型缺失、采样不足与低计数，事先确定最少细胞/覆盖规则并报告排除。细胞类型定义本身也可能受批次和注释错误影响；整合embedding不能直接替代计数检验输入。

差异丰度的分母

供体$d$中类型$t$的比例可记为 $p_{dt}=n_{dt}/N_d$，$N_d$是保留细胞数，并非组织中的所有细胞。一类增多会使其他类相对比例下降，组织解离、捕获和质控也会改变分母。使用比例、计数或邻域方法前明确目标；有配对供体应保留配对，而非全局乱序。

症状	原因候选	先检查
极小P由一名供体驱动	伪重复或离群供体	每供体效应图与样本数
某类型只在一组有	真实组成或捕获/注释差异	每供体细胞数与QC/来源
表达和比例结论相反	两个估计目标不同	是否在相同类型内比较
整合后差异消失	表示校正改变信号	原始计数、设计和整合用途

自测与答案

1. 每组一名供体、一万细胞能稳定估计人群条件效应吗？答：不能用细胞替代缺失的供体重复。
2. 没采到一种细胞可填全零pseudobulk吗？答：不应未经定义就当作已测零表达。
3. 类型占比下降是否表示每个细胞表达下降？答：组成与状态是不同问题。

在电脑上核对这一小步

先下载项目ZIP并解压，进入同时含README.md和examples的项目根目录。不熟悉终端和当前目录时读R与Python路径文件与项目组织。以下在系统终端执行，需Python 3.10+，只用标准库，无需pip安装；Windows可将python3替换为已安装的python或py。

python3 examples/methods_omics_demo.py --case pseudobulk

输入是脚本内置人工数字，不需下载专业数据。成功会打印JSON，并生成examples/output/methods-omics/pseudobulk/summary.json；cases.pseudobulk下的字段对应本页演算。非空输出目录会拒绝覆盖，第二次练习可在命令后加--output examples/output/methods-omics/pseudobulk-practice2。不要为了重跑删除不明来源的数据。

**检查点：**两组donor_equal_mean均为5；cell_weighted_mean约1.72727和4.18182。

阅读源码时先找到同名函数，逐一对照输入、运算与输出；要修改数字，先复制整个解压项目并运行副本，再手算新的预期。脚本含若干固定结果断言，修改教学条件时也需重新核对相应断言；断言失败不自动说明专业方法失效。本轮已实际运行全部22个标准库模式，Python 3.14.8；本页范围为供体权重反例；未拟合专业pseudobulk差异或差异丰度模型。演示没有为真实样本产生专业P值或性能结论。

来源与下一步

本轮查阅日期为2026-10-26；正文原始来源支持对应技术事实，手算与代码是本项目人工教学设计。方法页解释模型，安装及大数据运行交给相应工具/工作流页。教学组织参考GTN的步骤与检查点、Bioinformatics Workbook的问题驱动练习；未复制其教程正文。

保留的相关入口：合成数据贯通统计推断、原始研究、单细胞与空间组学验证设计。

学习顺序、前置与练习清单见方法与算法系统学习指南。

公式里的矩阵、下标或对数不熟时，可回查读懂方法公式的最小数学基础。