单细胞与空间组学验证设计

更新：2026-10-13；状态：可用；验证范围：原始研究与官方规范核对；实验设计说明，未执行湿实验或真实组学验证。

供体、细胞、切片和空间位置具有层级关系，验证需同时考虑统计单位和身份注释。

供体是关键单位之一

同一供体的细胞共享遗传和环境背景。比较供体分组的差异时，细胞通常不是独立生物学重复；批次整合也不自动消除这种相关性。可在适当设计下采用供体×细胞类型pseudobulk或显式表示供体的模型。

pseudobulk通常从原始计数按合适单位汇总，不是把任意归一化值平均后就交给计数软件。供体很少或某细胞类型在部分样本缺失时，需评估可估计性与缺失原因。

注释、差异与比例是三种问题

聚类与标记帮助提出细胞身份；细胞类型内组间差异表达比较状态；细胞类型比例比较组成。用于聚类和命名的相同标记不能作为唯一独立验证。

可以结合额外标记、外部参考、合适成像/空间定位或独立样本确认身份，仍需检查双细胞、环境RNA、批次和参考偏差。UMAP分离不是生物学身份的独立证据。

空间数据额外注意什么

同一组织切片的邻近spot有空间依赖，多张相邻切片也未必是多个独立供体。空间邻近表达可受细胞组成和组织结构影响；计算出的细胞通讯或邻近关系不自动证明配体实际激活受体。

验证可检查独立切片/供体中的区域重复、测量方法一致性和相应分子定位。保留图像配准、分割、spot混合及参考组织信息，不能只展示一张最清楚的区域。

已运行的统计反例

合成数据贯通统计推断生成20个独立人工供体、200个相关测量，真实组效应为0。按供体均值比较P=0.527，错误地把所有细胞独立处理P=0.0376。它是连续层级数据例子，没有运行真实scRNA-seq或空间模型。

原始流程见单细胞转录组入门与实践、空间转录组入门与实践。证据依据：伪重复原始研究、Confronting false discoveries in single-cell differential expression。