人工长读长贯通SV调用与评估

更新：2026-10-15；状态：可用；验证范围：对应人工/官方微型案例已实际运行；具体范围见正文。

实际从人工DNA reads比对到Sniffles调用、群体输出和Truvari两事件核对，并保留发现的格式问题。

环境与运行

下载项目ZIP并解压，在含README.md与examples的项目根目录运行。已有Conda时：

conda env create -f examples/environments/variant-calling.yml
conda run -n wiki-variant-calling python examples/variant_calling_demo.py

以下按Linux x86_64终端整理；Windows需适用Linux环境，其他系统未逐一实测。环境YAML按本机实际成功安装的同一组Conda软件约束整理，未另在各系统重建。环境包含Python/pysam、minimap2、samtools、Sniffles、Truvari及FreeBayes；实际Linux版本见维护记录。非PATH工具可设对应的MINIMAP2_BIN、SAMTOOLS_BIN、SNIFFLES_BIN、TRUVARI_BIN等绝对路径。

默认输出examples/output/calling-sv，非空目录拒绝覆盖。另练习用--output examples/output/calling-sv-practice2指定新目录；只运行小变异例用--case small，见FreeBayes小变异与倍性设置。

输入与实际链路

固定种子20261015生成100kb人工参考，V01为含500bp DEL和300bp INS的人工杂合样本，R01为参考对照；每个样本160条完美16kb DNA reads。minimap2用map-hifi仅为教学配置，不模拟真实HiFi错误。

先读变异发现联合分型与缺失状态：候选发现→中间证据→群体调用→在已知事件重新分型。具体为排序/索引BAM→单样本Sniffles VCF+SNF→SNF群体调用；另以V01候选在R01 BAM执行force。Truvari只评估V01相对两个已知人工事件，限定BED[10000,90000)、距离100、序列与大小相似度0.7、PASS及单匹配。

小参考显式使用--all-contigs，该参数不是实际物种自动推荐。群体步骤同时传参考并核对序列锚点。源码variant_calling_demo.py。

实际结果与重要反例

检查	实际结果
V01单样本发现	DEL/INS各1，GT均0/1
R01单样本发现	0条候选，不自动当全参考分型
SNF群体VCF	2事件；V01为0/1，R01保留./.
Truvari事件与GT	TP-base=TP-comp=2、FP/FN=0；匹配GT一致2
R01 force原生文件	FORMAT键数不一致，样本名继承候选，未直接作为合法结果使用
受限派生兼容副本	两事件GT为0/0，但GQ均0；保留DR/DV和修正记录

Truvari得分只针对两个易例，不代表真实SV准确率、复杂类型或全基因组性能。R01 force的低GQ也不应表述成高置信参考。

格式问题如何处理

本机Sniffles2.8.1 force输出FORMAT为GT:GQ:DR:DV，样本有第5个PS占位；原生头部样本名继承V01。程序保留raw，检查genotypeSource确为已验证的Sniffles2.8.1、已声明PS、单样本且精确符合已知4键/5值末尾点的模式后，在独立.compat副本补PS。经BAM RG确认实际样本R01后另记表头改名，保存原名/新名和两文件SHA；不改GT/GQ/DR/DV或INFO。

未知格式异常拒绝兼容处理，不能把这段逻辑当通用VCF修复器。DR/DV按本次头部分别为参考/替代支持read数，GQ为分型质量，PS为相位块字段；兼容副本未提升这些质量。force的INFO SUPPORT/VAF/COVERAGE可来自候选记录，当前样本证据读FORMAT，不能把继承INFO当R01支持。

公开汇总、图和原始/派生核对记录在结果目录。真实SV调用、其他平台、INV/DUP/BND及低频/多倍体性能未在本例验证。

去哪里核对产物

文件	用途与本例检查
V01.vcf / R01.vcf	分别有2条/0条候选
cohort.vcf	两个样本列，R01仍为./.
bench/summary.json	TP-base/TP-comp、FP/FN及GT一致性
R01.force.vcf	原生输出，保留格式异常供审计
R01.force.compat.vcf	受限格式/样本表头兼容副本，GQ=0仍非可信阴性
summary.json / commands.json	汇总及实际命令记录

成功运行会打印汇总。在项目根目录可用conda run -n wiki-variant-calling python -m json.tool examples/output/calling-sv/summary.json查看；再次运行请换新输出目录。

配图

配图另需Matplotlib；例如conda install -n wiki-variant-calling -c conda-forge matplotlib后，在项目根目录运行conda run -n wiki-variant-calling python examples/plot_variant_calling.py。需先完成SV和TRGT两个案例，默认读取其summary，图保存examples/output/variant-calling-plots。