RNA计数模型差异表达与效应收缩

更新：2026-10-26；状态：可用；验证范围：2026-10-26官方/原始来源核对；标准库教学演示实际执行；专业验证范围见正文。

问题与前置

差异表达不是简单比较两列计数，而是问条件间变化是否超过样本内/样本间的随机变异。学完应能区分归一化、离散度、检验和效应收缩。先读RNA文库大小因子与组成偏差、负二项离散度与均值方差和RNA设计矩阵配对与对比方向。

把每个符号对应到数据

对基因$g$、样本$j$，常见负二项模型为 $K_{gj}\sim NB(\mu_{gj},\alpha_g)$，$\mu_{gj}=s_jq_{gj}$，$\log q_{gj}=x_j^T\beta_g$。$K$是观察计数，$s_j$是相对文库尺度，$x_j$是设计矩阵一行，$\beta_g$描述条件及协变量，$\alpha_g$是离散度。其方差为 $\mu+\alpha\mu^2$；均值100、离散度0.1时方差1100，远大于Poisson的100。

DESeq2与edgeR使用相应计数模型和跨基因信息；limma-voom对变换后的计数估计均值—方差权重再拟合线性模型。它们对低计数、离散度和权重的处理不同，不是换个名称的普通TPM t检验。DESeq2方法与教程、limma用户指南支持这些方法区别。

先手算尺度，再理解模型

两组各两个样本，计数20、40、80、160，已知尺度1、2、1、2；除以尺度得到20、20、80、80，组均值倍数为4，log2FC=2。若只比较某两列40与80，会得到倍数2，混进文库尺度差。本例故意给定尺度，不是在四个数上估计DESeq2 size factor，也没有足够变异结构去检验真实显著性。

归一化不负责移除所有批次和混杂；设计矩阵定义比较与条件化关系。若批次1全是A、批次2全是B，负二项模型也不能从观测中唯一拆出两个效应。转录本估计导入、长度修正和整数计数接口各有约定，不能随意把TPM四舍五入冒充原始计数。

为什么要收缩LFC

一个低信息基因的原始LFC可能极端而SE很大。用独立的正态示意：观测效应$\hat\beta\sim N(\beta,s^2)$，先验$\beta\sim N(0,\tau^2)$，后验均值为 $\hat\beta\tau^2/(\tau^2+s^2)$。$\hat\beta=3,s=2,\tau=1$时得到0.6。信息弱时更靠近0，信息强时更靠近原估计。

这不是apeglm算法：真实实现可用不同先验、估计与区间。收缩便于稳定排名和展示，不等于把任意收缩LFC除以原SE产生新P值。检验“非零”和“超过有意义阈值”也不同，需调用支持相应原假设的接口。

操作链与检查点

输入为基因×样本计数、唯一且正确对齐的样本表、设计和明确对比。先核对计数来源、样本对应与重复，再定预过滤、拟合、诊断、对比及多重校正，最后按需要收缩效应。输出保留计数基线、LFC、SE/区间、原始P、padj、NA原因和完整检验家族；top50只适合预览。

症状	候选原因	检查
大量NA	全零、异常、独立过滤等	对照baseMean与具体模型状态
低计数LFC极大	信息弱或单样本驱动	原计数、SE与收缩前后
组方向颠倒	参考和contrast改变	显式写B−A及因子水平
所有基因同向	组成偏差或设计问题	size factor、样本图及控制依据

自测与答案

1. 标准化值相同意味着原始计数相同吗？答：不一定，尺度可以不同。
2. 方差1100能用Poisson方差100替代吗？答：会忽略相应过度离散。
3. 收缩后不显眼是否证明基因无效？答：只是估计与信息的综合，需结合区间和目标判断。

公开airway数据贯通DESeq2已有原生R的DESeq2/apeglm公开计数实测；本轮新增是下方模型算术，edgeR、voom和完整上游RNA流程不因此变成已测。

在电脑上核对这一小步

先下载项目ZIP并解压，进入同时含README.md和examples的项目根目录。不熟悉终端和当前目录时读R与Python路径文件与项目组织。以下在系统终端执行，需Python 3.10+，只用标准库，无需pip安装；Windows可将python3替换为已安装的python或py。

python3 examples/methods_omics_demo.py --case rna

输入是脚本内置人工数字，不需下载专业数据。成功会打印JSON，并生成examples/output/methods-omics/rna/summary.json；cases.rna下的字段对应本页演算。非空输出目录会拒绝覆盖，第二次练习可在命令后加--output examples/output/methods-omics/rna-practice2。不要为了重跑删除不明来源的数据。

**检查点：**normalized=[20,20,80,80]、normalized_log2_fold_change=2、NB_variance=1100、normal_prior_toy.posterior_mean=0.6。

阅读源码时先找到同名函数，逐一对照输入、运算与输出；要修改数字，先复制整个解压项目并运行副本，再手算新的预期。脚本含若干固定结果断言，修改教学条件时也需重新核对相应断言；断言失败不自动说明专业方法失效。本轮已实际运行全部22个标准库模式，Python 3.14.8；本页范围为已知尺度、负二项方差和正态先验演算；不重新运行DESeq2/apeglm，未运行edgeR/voom。演示没有为真实样本产生专业P值或性能结论。

来源与下一步

本轮查阅日期为2026-10-26；正文原始来源支持对应技术事实，手算与代码是本项目人工教学设计。方法页解释模型，安装及大数据运行交给相应工具/工作流页。教学组织参考GTN的步骤与检查点、Bioinformatics Workbook的问题驱动练习；未复制其教程正文。

保留的相关入口：RNA-seq从计数矩阵到差异表达、转录组差异与qPCR验证设计、公开airway数据贯通DESeq2、DESeq2官方教程、voom原始论文、edgeR原始论文、广义线性模型与逻辑回归、线性模型与混合模型、概率条件概率与贝叶斯定理、负二项离散度与均值方差、RNA文库大小因子与组成偏差、RNA效应收缩与阈值检验。

学习顺序、前置与练习清单见方法与算法系统学习指南。

公式里的矩阵、下标或对数不熟时，可回查读懂方法公式的最小数学基础。